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白细胞介素15及其受体在儿童急性白血病中的表达

2015-07-06 12:28 来源:学术参考网 作者:未知
【摘要】 目的 探讨il15水平及其受体在儿童急性白血病中的表达及作用。方法 取确诊未治的儿童急性淋巴细胞白血病(all)、儿童急性非淋巴细胞白血病(anll)和非白血病组儿童各20例,20例正常儿童的血清,测定不同组别对象血清il15的水平和不同组别对象的骨髓单个核细胞il15受体三个亚基α、β、γ的表达并进行半定量分析。结果 急性白血病患儿血清il15水平较正常和对照组均出现明显下降;il15受体α、β、γ亚基的表达水平也均较正常组和对照组明显下降,但all与anll组之间和非白血病组与对照组之间差异无统计学意义。结论 急性白血病患儿无论血清il15水平及其骨髓单个核细胞il15受体α、β、γ均出现下降。

【关键词】 急性白血病;白细胞介素15;受体;基因

levels of interleukin15 and its receptor subunit expression in children acute leukemia

ye zhonglv1, chen mingzhen1, chen riling1,huang xiulan1,pang weijun2, chen shuiwen3

1.department of pediatrics, affiliated hospital of guangdong medical college,zhanjiang 524001,china;2.department of laboratory;3.maternal and child health hospital, baoan district, shen zhen

corresponding author:chen mingzhen, email: chenminzhen @tom.comabstract:objective to investigate the expression of il15 and its receptor in children acute leukemia, contribute to understand their function on acute leukemia. methods every group of acute lymphocytic leukemia(all),acute myeloid leukemia (anll) or nonleukemia group had 20 children who did not receive any treatment. the expression of the interleukin15 receptor alpha,beta,gamma mrna in bone marrow were examined by rtpcr, and make an semiquantitative analysis. the level of il15 in serum of every group by means of elisa.results the level of il15 in al(all and anll)group, were significant was assayed in statistics(p<0.05)with healthy children and nonleukemia group .the difference which the il15 level of all compared with anll or the level of healthy children compared with nonleukemia group is neglected in statistics(p>0.05).the expression of il15r alpha,beta,gamma mrna in al is significantly different than that of healthy and nonleukemia children.the difference which the il15 alpha,beta,gamma of all compared with anll or the level of healthy children compared with nonleukemia group is neglectable in statistics (p>0.05). conclusion the il15 level of al children is lower than control group.and the expression that of il15rα,β,γ subunit in bone marrow mononuclear cell of al is smaller than those of nonleukemia group.

key words:acute leukemia; interleukin15; receptor;gene

免疫因素在白血病的发生发展中起着重要的作用,尤其是细胞免疫功能的变化,可能与白血病的发生密切相关;白细胞介素15(il15)是一种可溶性的淋巴细胞生长因子。WwW.133229.coM我们既往的研究发现,一定浓度的il15对骨髓增生异常综合征(mds) cd34+造血细胞有刺激增殖分化和抑制凋亡的效果,其机制可能是与il15上调bcl2、bclxl凋亡抑制基因和caspase3的表达有关[14]。最近,我们通过检测部分白血病患儿及其健康儿童的血清il15水平及其受体表达情况,探讨它们在儿童急性白血病中的表达及作用,现报告如下。

1 资料和方法

1.1 临床资料

所有标本分别来自本院新确诊的病例和健康体检的儿童,均未经过任何细胞因子、激素或化学药物的治疗。分组:急性白血病组患儿40例,年龄4~16岁,其中男26例,女14例;包括急性淋巴细胞白血病(all)患儿20例,男12例、女8例;急性非淋巴细胞白血病(anll)患儿20例,男14例、女6例;诊断标准按张之南主编《血液病诊断及疗效标准》第二版[5]。非白血病组患儿20例,男13例,女7例,年龄在2~13岁,其中缺铁性贫血患儿10例、巨幼细胞性贫血患儿4例、葡萄糖6磷酸脱氢酶 (g6pd) 缺乏症缺乏患儿3例和地中海贫血的患儿3例。正常儿童对照组20例,年龄在4~10岁之间,其中男10例,女10例。

1.2 方法

1.2.1 标本采集

抽取不同组别对象的外周血5ml,用离心机2 000g/min,离心5min,吸取血清转移到另一管,-20℃保存待测。同时抽取骨髓5~10ml,置含肝素的抗凝管中,充分混匀,即时分离单个核细胞,操作过程注意无菌。

1.2.2 il15测定

分离好的血清在常温下解冻20min,从4℃冰箱取出il15 elisa试剂盒在室温下放置20min,平衡至室温。其余的操作按试剂盒说明进行。

1.2.3 pbmc分离、总rna的提取、目的基因rtpcr扩增

(1)引物设计与合成

il15受体α、β、γ亚基基因的mrna从genbank中找出,引物根据primer软件设计,由上海生工生物工程技术服务合成。引物序列为:βactin:(528bp)上游5′ ctacaatgagctgcgtgtgg 3′,下游5′ aaggaaggctggaagagtgc 3′;il15rα:(203bp)上游5′ cacctatg aaa ctcggggaaac 3′,下游 5′ atgggaatgcggag aa cc 3′,il15rβ:(236bp)上游5′ gtgcgatggagggtgatg  3′,下游5′ cattcctgcttctgcttgag  3′,il15rγ: (428bp) 上游5′ cattggaagccgtggttatc 3′,下游5′ ggtgagtatgagacgcaggtg  3′。

(2)rtpcr

按qiagen公司的rtpcr一步法试剂盒说明书操作。其具体步骤为:先加入标本和试剂(冰上进行),然后于pcr仪上进行扩增,参数及条件如下:50℃ 30min,反应条件为94℃,预变性15min,34个循环:94℃变性45 s;50℃~68℃退火30 s;72℃延伸45 s;最后72℃延伸10min,总反应体积为25μl。其中α亚基的退火温度为53℃,β亚基的退火温度为53℃,γ亚基的退火温度为54℃,βactin的退火温度为55℃。α亚基的循环次数为31次,β亚基的循环次数为35次,γ亚基的循环次数为35次,βactin的循环次数为31次。

1.2.4 电泳和图像分析

取目的基因产物和内参产物混匀,于2%琼脂糖凝胶电泳,紫外透射仪观察结果,并拍照图片,图片经扫描仪扫描后,用sigmascan 5.0图像分析软件进行光密度积分值分析,分别计算出检测基因与βactin (内参)的光密度值之比,作为其相对含量值。

1.3 统计学方法

计量资料用±s表示,使用spss11.5统计软件进行统计分析,多个样本均数的比较采用单因素方差分析,两两比较采用q检验。

2 结果

2.1 白细胞介素15的水平

不同组别血清中白细胞介素15的水平检测,急性淋巴细胞白血病组的il15浓度为(34.37±2.8)pg/ml,急性非淋巴细胞白血病组的浓度为(29.61±3.2)pg/ml,正常对照组的浓度为(122.23±4.2)pg/ml,非白血病组的浓度为(117.54±3.9)pg/ml;其中all、anll组il15的浓度分别和正常对照组的浓度进行比较,p均<0.05,差异有统计学意义。all、anll组il15的浓度分别和非白血病组的浓度进行比较,p均<0.05,差异有统计学意义。all和anll组比较、正常对照组和非白血病组比较,p均>0.05,差异无统计学意义,见表1。表1 不同组别外周血清中il15浓度

2.2 不同组别的骨髓单个核细胞的il15受体α亚基基因表达

il15受体α亚基条带在非白血病组最清晰,all组、anll组、非白血病组的表达率分别是75%、75%、100%,α亚基表达的病例中灰度扫描结果比值分别为0.4618±0.1460、0.4952±0.1271、0.8964±0.2130。all组、anll组灰度扫描结果的比值分别和非白血病组的比值进行比较,p均<0.05,有显著性差异。而且all组灰度扫描结果的比值与anll组的比值进行比较,p>0.05,差异无统计学意义,见图1。

2.3 不同组别的骨髓单个核细胞的il15受体β亚基基因表达

il15受体β亚基条带在非白血病组最清晰,all组、anll组、非白血病组的表达率分别是80%、85%、100%,β亚基表达的病例中灰度扫描结果比值分别为0.5391±0.1740、0.5514±0.1961、0.8846±0.1310。all组、anll组的灰度扫描结果比值分别和非白血病组的比值进行比较,p均<0 .05,差异有统计学意义。而且all组灰度扫描结果的比值与anll组的比值进行比较,p>0.05,差异无统计学意义,见图2。

2.4 不同组别的骨髓单个核细胞的il15受体γ亚基基因表达

il15受体γ亚基条带在非白血病组最清晰,all组、anll组、非白血病组的表达率分别是80%、80%、100%,γ亚基表达的病例中灰度扫描结果比值分别为0.5104±0.1245、0.4997±0.1072、0.9062±0.2013。用all组、anll组灰度扫描结果的比值分别和非白血病组的比值进行比较,p均<0.05,有显著性差异。而且用all组灰度扫描结果的比值与anll组的比值进行比较,p>0.05,差异无统计学意义,见图3。

3 讨论

通过检测il15水平,结果all组、anll组血清il15的水平均较非白血病组和正常对照组低,但all和anll的血清il15水平差异无统计学意义,说明il15在急性白血病患儿中的表达水平要比正常儿童的低。由于il15具有一定的免疫介导作用,其水平下降,可能是导致急性白血病患儿免疫功能低下的原因之一,郭承吉等 [6]发现il2也存在类似现象。由于il15和il2有着广泛的同源性;是否急性白血病血清il15的水平也与病情及预后相关,而通过调节或刺激体内的细胞因子水平,是否可以达到一定的抗肿瘤作用[7]?因此,对白血病患儿的il15水平进行动态观察,可能有助于观察al的病情发展,判断预后及预测复发。

在atl疾病,人类t细胞白血病病毒ⅰ(htlvⅰ)感染的细胞其il15rαmrna表达显著升高,而且htlvⅰtax蛋白的表达可进一步使il15rαmrna水平升高,表明il15rα在atl细胞增殖中有一定的作用[8]。也有发现il15r高表达的白血病患儿其预后较好,生存期长,目前机制未明[9];本课题用rtpcr方法从分子水平上检测骨髓中单个核细胞il15r亚基mrna的表达,检测显示:all组、anll组、非白血病组il15受体α亚基mrna的表达率分别是75%、75%、100%;β亚基mrna的表达率分别是80%、85%、100%;γ亚基mrna的表达率分别是80%、80%、100%,其中α亚基在bmmc的表达率未见有文献报道;β亚基表达率较文献[10]报道偏高,与文献[11]结果相似;而γ亚基的表达率和文献[11]报道基本一致。而且在all组、anll组中il15r三个亚基mrna的表达水平均比非白血病组低,说明急性白血病il15 受体三个亚基无论是表达率还是表达水平均要低于非白血病组。

在白血病中,除少数类型白血病细胞外,人们检测到大多数白血病细胞有fas 的高表达[12] , fas/fasl 系统作为诱导细胞凋亡的一条重要途径,也参与了白血病的发病过程。并且发现fas的表达与白血病的病情进展、治疗效果及预后密切相关。已有研究表明il15不仅能阻止自发的凋亡而且能够阻止fas引起的死亡信号介导的广泛凋亡[13];而且bcl2 家族通过调节某些细胞中的fas 介导凋亡,尤其是bcl2 基因的上调,能对一些肿瘤提供fas 抗性[14] ,对白血病细胞的作用则是阻止分化细胞凋亡。因此,il15r在急性白血病的发生发展中是否起到一定的作用,从而在一定程度上导致al发生的问题值得进一步探讨。

【参考文献】
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