【关键词】 慢性粒细胞性白血病；ship2;格列卫；加速；急变
【摘要】 目的 研究ship2基因在慢性粒细胞性白血病（chronic myelogenou leukemia,cml）中的表达及意义。方法 采用定量pcr的方法分别检测43例cml患者，其中慢性期35例（包括未经格列卫治疗的慢性期患者25例；格列卫治疗者10例）；加速、急变 期患者8例（未经治疗）及10例健康对照中的ship2 mrna 表达，比较各组中表达水平的差异，并进一步分析其意义。结果 25例cml慢性期初治患者中， ship2基因平均水平低于正常对照组（t=7.615,p＜0.01）；经格列卫治疗的慢性期患者表达水平低于正常对照组（t=4.572,p＜0.01），但高于初治组的表达（t=4.572,p＜0.01）；加速、急变期患者表达水平低于正常对照组（t=7.615，p＜0.01）及初治组（t=2.104,p<0.05）的表达。结论 ship2在cml中的表达减低，在急变后会进一步减低可能参与了cml的发病,而应用格列卫后其表达水平增高，提示其表达可能受bcr/abl基因的调节。
【关键词】 慢性粒细胞性白血病；ship2;格列卫；加速；急变
expression and significance of ship2 in patients with chronic myelogenous leukemia
liu xiaojun,yang lin,wen shupeng,et al.
department of hematology,the second hospital of hebei medical university,shijiazhuang 050000,china
【abstract】 objective to investigate the expression and the clinical significance of ship2 in patients with chronic myelogenous leukemia (cml). methods the semiquantitative pcr was used to detect the expression of ship2 in 43 patients with cml including 35 patients at chronic phase (25 cases untreated,10 cases treated by glevic ), and 8 patients untreated were at accelerate period or blast period. 10 healthy subjects were enrolled as control group.results the average level of ship2 mrna in the 25 patients untreated was 0.0198±0.0190,which was significantly lower than that (0.1246±0.0628) in control group (p<0.01).the average level of ship2 in patients treated by gleevic was 0.0312±0.0131,which was significantly lower than that in control group (p<0.01),but which was significantly higher than that in the patients untreated (p<0.01). the average level of ship2 in 10 patients at accelerate period or blast period was 0.0054±0.0029,which was significsntly lower than that in control group (p<0.01) and the patients untraeted(p<0.05). conclusion the ship2 expression decreases in cml patients,which is much lower in patients at accelerate period or blast period, which may take part in the development of cml. gleevic can increase the expression of ship2,which indicates that the expression of ship2 may be regulated by bcr/abl gene.
【key words】 chronic myelogenous leukemia; ship2; accelerate period; blast period
慢性粒细胞白血病(cml)大约95%患者伴有t(9;22)(q34;qll) 染色体易位,在22号染色体产生bcr/abl融合基因，编码具有高酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase, ptk)活性的融合蛋白，可激活多种信号转导途径,其中磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3kinase, pi3k)途径是bcr/abl调控的一系列信号转导途径中最重要的一条。WWw.133229.coMpi3k催化生成的 pip3，是重要的第二信使，对多种细胞功能如生存、增殖、黏附/迁移、葡萄糖的运输代谢以及能量的动态平衡等起着重要的调节作用［1］。ship2表达广泛，在造血细胞与非造血细胞均有表达。作为肌醇5’磷酸酶家族中的一员，ship2可以作用于底物pi(3,4,5)p3、 pi(1,3,4,5)p4以及pi(4,5)p2［2］。我们的前期工作已显示，ship1在cml的发生中起了一定的作用［3］，为了明确ship2是否同样参与了cml的发生发展，本试验采用定量pcr方法检测了cml患者ship2基因的表达情况，同时还检测了应用酪氨酸激酶抑制剂后基因表达的改变情况，进而了解ship2基因在cml中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择我院血液内科2007年2月至2009年1月住院和门诊随访的bcr/abl融合基因检测阳性的cml患者，b3a2型24例；b2a2型18例；b2a2、b3a2混合6例。其中慢性期（chronicphase，cp）35例（25例未经格列卫治疗的初治患者及10例经格列卫治疗的患者），加速期(accelerated phase，ap)、急变期(blastic phase，bp)8例。经过micm即形态学(morphology,m)、免疫学(immunology,i)、细胞遗传学(cytogenetic,c)和分子遗传学(moleculargenetics,m)诊断，符合fab诊断标准。10名健康志愿者作为正常对照组。白血病患者为全部43例患者，包括男23例，女20例；年龄20～60岁，平均年龄40岁。正常对照组10例，其中男5例，女5例；年龄18～42岁，平均年龄29岁。
1.2 分组设计
将研究对象分为cp初治组、cp经格列卫治疗组、ap及bp组和正常对照组。观察睦组中ship2基因的表达情况
1.3 方法
荧光定量pcr检测ship2在4组的表达情况：取4组骨髓，分离单个核细胞，取2×106细胞trizol一步法提取细胞mrna用紫外分光光度仪（北京普析通用仪器公司）检测其浓度。配置定量反应体系（均购自promage公司）random primer (500 g/ml)1 l， dntp (10 mmol/l) 1.5 l，rnasin 0.5 l， 5×mmlv buffer 5 l，mmlv 2 l 补充depc水使体系为25 l）。逆转录反应条件为: 37℃1 h, 95℃ 3 min。pcr反应体系为: 10×pcr buffer (mg 2.5 mol/l) 2.5 l，dntp(10 mmol/l)0.5 l， primer(10 pmol/l) 2 l，dna模板2 l，注射用水16.5 l， taq dna polymerase 0.5 u，20×sybr green 1μl。反应条件为:反应条件为: 94℃ 2 min, 94℃ 45 s, 60℃ 45 s，72℃ 45 s,共35个循环。引物序列ship2 上游引物： 5′acgtgacatcctggttcaca3′ 下游引物： 5′gcggtaatccagatccgtaa3′ βactin 上游引物: 5′tcatcaccattggcaatgag3′下游引物: 5′cactgtgttggcgtacaggt3′。 ship2的扩增片断长度173 bp，βactin的扩增片断长度155 bp。基因的相对表达量计算公式:δδct=2-δct δct=ct(t)-ct(r)。
1.4 统计学分析
应用spss 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，p＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 正常对照组均表达ship2基因，基因相对表达水平范围为0.0107～0.2736，表达水平平均0.1246±0.0628。
2.2 在25例cml cd初治组中，均表达ship2基因，平均水平为0.0198±0.0190，其表达水平低于正常对照组，差异有统计学意义（t=7.615，p＜0.01）。
2.3 经格列卫治疗的cp患者10例均表达ship2基因，表达水平平均为0.0312±0.0131。其表达水平低于正常对照组差异有统计学意义（t=4.572，p＜0.01）。其表达水平高于cp初治组，差异有统计学意义（t=4.572，p＜0.01）。
2.4 10例bd患者中均表达ship2基因，表达水平平均0.0054±0.0029。其表达水平低于正常对照组，差异有统计学意义（t=7.615，p＜0.01）。其表达水平与cp初治组相比差异有统计学意义（t=2.104，p<0.05）。
3 讨论
cml是一种原发于造血干（祖）细胞的恶性克隆性疾病，其发病与bcr/abl融合基因异常表达而导致髓系细胞异常增生分化密不可分。bcr/abl融合基因由9号和22号染色体异位形成，该融合基因产物p210bcr/abl蛋白的ptk活性异常增高，是cml发病重要的物质基础。该蛋白通过与衔接蛋白分子grb2、shc、crkl相互作用，激活pi3k/akt、rasrafmapk等信号转导途径，对bcr/abl引起的恶性转化起重要作用［4］。pi3k/akt途径作为细胞内重要信号转导通路之一, 通过影响下游凋亡相关蛋白、细胞周期调节蛋白等效应分子的活化过程,在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用。pi3k/akt通路过度激活会使细胞生存与凋亡失衡,甚至发生恶性转化［5］。ship2作为5’磷酸酶家族中的一员对细胞内的第二信使pi(3,4,5)p3有重要的调节作用，而作为pi3k/akt途径上的重要环节，pip3对pi3k/akt途径起着重要的调节作用，因而ship2的表达量与活性变化直接关系着pip3的水平影响着pi3k/akt途径生物学效应的发挥［5］。
有研究表明ship2的活性水平与其在体内蛋白表达水平呈正相关［6］。为明确ship2是否在cml中出现表达异常，我们选取了cml患者bcrabl阳性的的骨髓细胞，采用定量rtpcr的方法对cml慢性期初治患者及急变期患者骨髓细胞进行了ship2表达水平的检测。结果发现在慢粒病慢性期初治组患者细胞中，ship2的表达水平低于正常人。提示ship2在cml患者体内的活性水平减低。giuriato等［7］在k562细胞中的研究结果显示，ship2可通过降解pi(3,4,5)p3控制细胞内的pi3k/akt 途径，从而控制细胞的增殖，并能逆转由bcr/abl基因造成的g2/m核查点的消失。因而理论上讲，ship2在 cml患者中表达减低，有可能促进了细胞的增殖，参与cml患者的发病过程。
蛋白酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼（im）可竞争性结合abl酪氨酸激酶催化部位的atp结合位点,使该激酶不能与atp结合,从而失去催化活性。im使几乎所有cml慢性期患者达到完全血液学缓解和其中90%的早期患者达到完全细胞遗传学缓解。 本研究结果显示应用格列卫治疗的慢性期患者表达较初治患者增高，但仍低于正常人的表达，说明酪氨酸激酶抑制剂可以使ship2基因表达提高，推测ship2基因在cml中表达减低可能与bcr/abl融合基因对其抑制作用有关。
cml急变机制不明，众多因素诸如出现额外异常染色体及癌基因抑癌基因较少或失活等被相继提出。我们的研究显示ship2基因的表达水平明显低于慢性期患者，几乎为零，提示ship2 基因的表达可能与cml的进展有关，然而是因是果尚难断定，有待进一步研究确证。
【参考文献】
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3 刘小军，罗建民，杨琳.慢性粒细胞性白血病中ship1基因的表达变化及机制探讨.解放军医学杂志,2008，33:161164.
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