急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）以分化阻滞的不成熟细胞大量聚集于骨髓为特点，临床常通过检查骨髓细胞形态、免疫标记和遗传学分析对患者进行诊断。CD25是高度亲和白细胞介素2的受体α链，可参与抑制CD4+CD25+T细胞增殖，使AML患者对白血病细胞的免疫作用缺陷。已有研究提出，CD25可表达率在Ph+ALL显著增加，并提示疾病预后不良。本研究通过流式细胞术检测CD25在AML患者骨髓内的表达情况，探讨其与常用的实验室免疫标记的关系和FLT3-ITD基因突变分子的潜在联系。
1 资料与方法
1.1临床资料
选择我院36例初诊AML患者，男21例，女15例，年龄15～63岁，中位年龄39岁；平均白细胞计数（WBC）为（11.5±8）×109/L，平均血红蛋白浓度（Hb）为（83±12.3）g/L，平均血小板计数（PLT） （48±15.7）×109/L，骨髓原始细胞比例（Marrow blast%）为（89±7）%；参照《血液病诊断及治疗标准》对所有病例进行细胞形态学、免疫学、细胞遗传学和分子遗传学（MICM）检查，其中AML-M1 2例，AML-M2 8例，AML-M3 4例，AML-M4 11例，AML-M5 10例，AML-M7 1例。
1.2 PCR检测
按DNA提取试剂盒（购自TIANGEN）说明书操作。吸取与EDTA抗凝剂混合的骨髓液200 μL，加入20 μL蛋白酶K，混匀。加200 μL缓冲液GB，充分混匀，于56℃恒温水浴箱放置10 min以上，必要时延长时间使溶液变清亮。加500 μL无水乙醇吹打混匀，若液体黏稠，可再加无水乙醇200 μL，此时可能见到絮状沉淀。将吸附柱CB3放入收集管并编号，12 000 rpm离心1 min，若观察到吸附柱堵塞，可将堵塞物吸出后再离心。弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管，加入500 μL缓冲液GD，12 000 rpm离心1 min，弃掉收集管中的废液。吸附柱放回收集管，加入700 μL漂洗液PW，12 000 rpm离心1 min，丢弃废液后吸附柱放入收集管。加500 μL漂洗液PW，12 000 rpm离心30 s，丢弃废液后吸附柱放入收集管。12 000 rpm离心2 min，倒掉废液。吸附柱转移至干净的离心管，向吸附膜中间位置悬空滴加100 μL去离子水，室温放置2～5 min，12 000 rpm离心2 min，将溶液收集到离心管，作为FLT3-ITD扩增的DNA模板。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，FLT3-ITD的上游引物5'-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3'，下游引物5'-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3'。反应体系为上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，PCRmix10 μL（购自Takara公司）。PCR反应条件：94℃ 6 min，56℃ 1 min，72℃10 min，共30个循环。制作2%琼脂糖凝胶，吸取PCR产物5 μL，凝胶成像系统中拍照，判读结果。
1.3 流式细胞术
免疫表型标记单克隆抗体CD7、CD117、CD33、CD34、CD38、cyMPO、CD13、CD36、CD56、CD11b、CD19、 CD16、CD14、CD64、CD25、CD122、CD132等试剂均为美国BD公司产品。①膜抗原检测：各色荧光单克隆抗体加入流式管中，加入上述EDTA抗凝骨髓液500 μL。室温孵育20 min，加150 μL溶血素充分混匀，静置，待溶液透亮无絮状沉淀，加PBS 1 mL 1000 rpm离心5 min，弃上清。加500 μL PBS后上机检测。②胞浆抗原检测：500 μL骨髓液与100 μL固定液孵育20 min，加PBS 1 mL1000 rpm离心5 min，弃上清，加100 μL破膜剂混匀静置观察溶液透亮后，加PBS 1 mL 1000 rpm离心5 min，弃上清，加搭配好的各色单克隆抗体，常温、避光孵育20 min，加PBS 1 mL1000 rpm离心5 min，弃上清，加500 μL PBS上流式细胞仪检测。③单克隆抗体表达大于同型对照的20%为阳性。
1.4 统计学分析
采用SPSS软件16.0进行统计学分析，描述偏态分布资料为中位数（Median），描述正态分布资料为均数±标准差（x±s）。Wilcoxon rank sum test进行两样本间假设检验，采用Fisher精确概率法进行两样本率的比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CD25在36例AML患者中的表达结果
表达CD25的骨髓原始细胞占总骨髓原始细胞百分比>20%共5例，全组CD25+表达率为13.89%（5/36）。CD25分别在AML-M2组表达率为12.5%（1/8）、AML-M4组为18.18%（2/11）、AML-M5组为20%（2/10），余组未检测到CD25表达。Fisher精确概率法检验，CD25+表达率在各组间差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。
2.2 CD25与36例AML患者免疫表型的相关性
表达CD7、CD117、CD33、CD34、CD38、cyMPO、CD13、 CD36、CD56、CD11b、CD19、CD16、CD14、CD64、CD122、CD132单克隆抗体的骨髓原始细胞百分比在CD25+AML-M2组和CD25-AML-M2组间、CD25+AML-M4组和CD25-AML-M4组间、CD25+AML-M5组和CD25-AML-M5组间差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。36例AML患者均无CD122、CD132表达。
2.3 CD25与FLT3-ITD基因突变的相关性
PCR结果显示，FLT野生型条带只有一条，在310 pb附近，当FLT出现内部串联复制时，会在正常条带上方出现分子量大于FLT的条带（图1）。在36例AML患者中有7例伴随FLT3-ITD突变基因，FLT3-ITD的表达率为19.4%（7/36）。5例CD25+AML患者组中FLT3-ITD+者为3例，CD25+AML合并FLT3-ITD+率为60%（3/5），CD25+AML组与CD25-AML组比较，FLT3-ITD+表达差别有统计学意义（P=0.044）。
3讨论
急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML） 病因不明确，治疗以化学治疗为主，70%～80%可以达到完全缓解，但多数患者常因疾病复发导致长期生存率仅30%～40%。根据FAB将AML分为7种亚型，其中急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是一种特殊类型，PML/RARα融合基因是其特征性表达基因分子，通过三氧化二砷及维甲酸联合靶向诱导细胞分化治疗，90%以上的患者可以获得治愈。AML免疫表型以表达MPO、CD117、CD13、CD33、CD15、CD64常见，约50%～60%的AML患者可以检测出异常核型，不同异常核型对AML患者预后有各自不同影响。随着分子遗传学技术的发展，发现了许多异常遗传分子，与白血病的发病和预后有深远的关系。AML合并AML1/ETO和CBFβ/MYH11融合基因时，对化学治疗敏感，预后较好，此外在合并有NPM1、CEBPα时预后也相对良好。当出现复杂核型、单倍体核型、MLL重排、C-KIT、DNM
T3A和FLT3-ITD时，对AML预后存在不良影响。
有研究发现，CD25在BCR/ABL+急性B淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphocytic leukemia，B-ALL）患者中呈高水平表达，在长期生存（overall survival，OS）分析方面，诊断为B-ALL伴BCR/ABL融合基因阳性的患者中，合并有CD25+患者的OS较CD25-患者中位OS明显缩短。因此，CD25作为B-ALL判断预后的新生物学指标，提示不良预后。
本研究对36例AML患者进行CD25抗体标记，运用流式细胞术检测抗体荧光，探讨CD25与AML的相关性。结果显示，本组36例AML患者有5例表达CD25+，表达率为13.89%（5/36）。国外研究在大样本量（657例）的AML中检测CD25+表达率为13%，并在不同的骨髓细胞形态学阶段，即AML-M0～M7间均有表达，各个亚型间CD25+的表达率无明显差别，而CD11b常表达于CD25+AML，其余髓系免疫表型，如CD33、CD117、CD13、CD15、CD64与CD25相关性均无统计学意义。本实验收集到2例AML-M1、8例AML-M2、4例AML-M3、11例AML-M4、10例AML-M5、1例AML-M7，在AML-M1组、AML-M3组、AML-M7组内未检测到CD25的表达，在AML-M2组、AML-M4组和AML-M5组检测到并分析了CD25在各组间表达差别均无统计学意义，提示CD25表达与髓系白血病细胞的不同细胞形态学停滞阶段无相关性；同时在各组内CD7、CD117、CD33、CD34、CD38、cyMPO、CD13、 CD36、CD56、CD19、CD16、CD14、CD64在CD25+和CD25-组间表达无统计学差异，说明CD25与常见的髓系免疫表型分子无明显相关性，对AML的诊断意义较低。与国外研究不同的是，本实验中CD11b在AML-M2组、AML-M4组和AML-M5组内的表达情况与CD25无明显相关性，差异无统计学意义，可能与本实验收集病例数较少有关，不能明确CD25在全部AML中的表达情况，需要扩大样本量以证明CD11b及其他髓系免疫表型在CD25+AML中的表达情况。
有国外研究提出，CD25+AML中76%的患者合并FLT3-ITD突变。FLT的内部串联复制（ITDs）则形成FLT-ITD突变，翻译形成异常蛋白信号分子通过下游STAT5信号通路使细胞发生恶性增殖。FLT3-ITD突变在成人AML患者的发生率约为24%。PCR检测本组AML患者中有7例FLT3-ITD+，FLT3-ITD+的表达率为19.4%（7/36）。CD25+AML组中FLT3-ITD+表达率为60%（3/5），FLT3-ITD+在CD25+AML组CD25-AML组的表达水平差异有统计学意义，提示CD25+AML患者合并FLT3-ITD基因突变率较高。AML合并FLT3-ITD突变时提示疾病预后不良。有研究显示，CD25+FLT3-ITD+AML患者中位无复发生存（relapse free survival，RFS）时间为6个月，较CD25-FLT3-ITD+AML患者中位RFS时间（38个月）明显缩短，而CD25+FLT3-ITD-和CD25-FLT3-ITD-AML患者的中位RFS时间分别为28、47个月；在FLT3-ITD+AML患者的长期生存（overall survival，OS）分析中，CD25+组的中位OS时间为8个月，较CD25-组25个月的中位OS时间明显缩短。因此，AML患者合并有FLT3-ITD和CD25表达时，疾病复发时间和长期生存时间均缩短，CD25是AML不良预后的潜在指标，但CD25对AML预后影响的独立性，仍需要进一步明确。
虽然CD122、CD132在36例AML中未见表达，提示IL-2不能通过受体直接对髓系白血病细胞发挥生理作用，但IL-15可以通过与IL-2Rα有相似空间结构的IL-15Rα分别与IL-2Rβ、IL-2Rγ组成受体，替代IL-2激活Jak-STAT、MAP激酶和磷酸酰肌醇-3-激酶途径，从而对细胞发挥增殖调节作用。FLT3-ITD蛋白常通过STAT5信号通路使细胞发生恶性增殖，从而诱发白血病。目前IL-2R的Jak-STAT信号传导途径与FLT3-ITD蛋白下游STAT5信号通路之间的关系尚未明确，需要深层次的基础性研究来解释。在相关临床研究中，已证实CD25对AML患者的预后存在潜在不良影响，因此明确CD25与AML的相关性有一定临床意义。
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