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X射线照射后Rac1蛋白对慢性粒细胞白血病K562细胞

2015-07-25 09:12 来源:学术参考网 作者:未知

Racl全称为Ras相关的C3肉毒素底物1,基因全长29Kb,定位于人染色体7p22,其转录产物有1.2kb和2.5kb两种,均在组织特异性高的组织中表达[1,2],Rac1蛋白主要通过影响细胞形态,细胞的迁移,细胞周期进,基因转录调节,细胞的增殖、凋亡,血管形成等多方面来对肿瘤起作用。本次实验主要研究Rac1蛋白对辐射诱导K562细胞凋亡的影响机制。
  1资料与方法
  1.1一般资料 K562细胞株购自上海中科院细胞研究所,RPMI-1640培养基为四季青公司产品,新生牛血清为Gibco产品,藻红B染色购于上海四季青公司,兔抗Rac1(c-14)多克隆抗体、羊抗兔IgG二抗、兔源性抗人Actin抗体均购自美国Santa Cruz公司,直线加速器购于西门子公司(剂量率200cGy/min)。
  1.2细胞凋亡分析 K562细胞用含有10%新生牛血清的RPMI1640培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养至对数生长期,X射线分0、2、4、8 Gy四个剂量点照射对数生长期K562细胞,于照后24h和72h收集细胞,用染料藻红B﹙Erythrosine B﹚对细胞染色,活细胞不能被染色,死细胞的核被染成红色,根据被染色细胞占总观察细胞的百分率计算细胞的凋亡率,每次处理观察200个细胞。
  1.[第一论文网lunwen. 1KEJIAN.C OM专业提供写作论文和毕业论文写作服务,欢迎您的光临]3 Western blot 0、2、4、8 Gy的X射线照射对数生长期K562细胞,于24 h、72h收集细胞,用含苯甲基磺酰氟的裂解液提取细胞总蛋白,未经照射的细胞作为对照组,BCA法测定蛋白浓度,等量蛋白上样,12%SDS-PAGE凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜上。5% 脱脂奶粉室温封闭3h。洗膜后加入兔抗Rac1(c-14)多克隆抗体(1:1000稀释)封闭2h,TBST洗膜3次,10min/次,加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1:2000稀释)37℃ 杂交1h,曝光、显影、定影。
  1.4统计学处理 数据用SPSS11.5统计软件进行分析。剂量资料用均数±标准差表示,两组间比较采用均数t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
  2结果
  2.1不同剂量X射线照射K562细胞的凋亡率 用0、2、4、8 Gy的X射线照射K562细胞,分别在24h、72h时收集细胞,藻红B染色的方法检测细胞的凋亡率,由表1可以看出,随着剂量的增加,两个时间点的凋亡率亦增加,呈现一定的剂量相关性。由表1亦可看出受照后72h的细胞凋亡率明显高于24h的细胞凋亡率。
  2.2 X射线照射后K562细胞中Rac1蛋白表达变化 0、2、4、8Gy的X射线照射K562细胞后,由图1可见总的Rac1蛋白表达未发生明显变化,72h时Rac1蛋白表达水平比24h时Rac1蛋白表达水平有所减少。
  3讨论
  细胞凋亡(apoptosis)是正常机体细胞在受到刺激后出现的一种自发的程序性死亡过程,它是一个能被抑制或激活的可调节过程,调节失衡则是肿瘤产生的一个重要机制。电离辐射可通过直接或间接作用抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡。本实验所选的K562细胞在8GyX射照射后72h时细胞的凋亡率仅约13%,表现出一定程度的电离辐射抗性,但随着照射剂量的增加和时间的延长,K562细胞凋亡率有逐渐升高趋势,呈现时间、剂量依赖性。而Racl作为Rho蛋白家族中的重要一员,是Ras基因的下游分子,参与了ras基因的恶性转型,而其本身也是个癌基因,它的激活也可以导致细胞的癌变[3]。有研究发现它在宫颈癌、结肠癌 、胰腺癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达,其主要通过促进肿瘤细胞的增值、侵袭和转移在肿瘤的发生发展中发挥重要作用[4-8]。有研究发现活化的Rac1可促进整合素类蛋白分子在细胞头部表面募集,进而诱导肌动蛋白微丝聚集于细胞质膜,导致细胞膜多极化,从而影响细胞的运动迁移,它还可以激活Ⅳ型胶原酶,促进细胞外基质降解,增强肿瘤细胞侵袭穿透能力。Rac1也可通过调节NF-kB活性及增加[第一论文网lunwen. 1KEJIAN.C OM专业提供写作论文和毕业论文写作服务,欢迎您的光临]细胞内超氧化物阴离子的浓度进而抑制肿瘤细胞凋亡。Rac1有可能作为反映肿瘤生物学行为的一种新型标志物。本研究采用不同剂量的X线照射慢性粒细胞白血病K562细胞,WB方法检测不同时间点Rac1蛋白的表达,发现照射前后总的Rac1蛋白表达量无明显变化,但随着时间的延长,Rac1蛋白的表达量有所减少。由此可推断Rac1参与了辐射诱导K562细胞凋亡的过程。Rac1蛋白表达的减少可促进K562细胞的凋亡率的增加,抑制Racl蛋白表达可以促进K562细胞的凋亡。这将为临床肿瘤放射治疗提供新的治疗靶点。
  参考文献:
  [1]Duran RV,Hall MN.Regulation of TOR by small GTPases.EMBO Rep 2012;13:121-128.
  [2]Paulo Matos, Jennifer Skaug; et al. Small GTPase Rac1: Structure, Localizationand Expression of the Human Gene[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2000,277:741-751.
  [3]Wang, Qing Rao; et al.Overexpression of Rac1 in leukemia patients and its role in leukemia cell migration and growth[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2009,386 :769-774.
  [4]魏世平,王克猛.结直肠癌中Racl的表达研究[J].河北医药,2011,33:3701-3702.
  [5]田锐,郭兴军.Racl对胰腺癌增殖的影响及其机制[J].世界华人消化杂志, 2013,21(12):1070-1074.
  [6]鄢毅权,李介秋.Racl基因在肝细胞癌中的过表达与转移侵袭的关系[J].医学临床研究,2007,24(9):1493-1498.

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