【关键词】 livin 基因;白血病;逆转录聚合酶链反应
【摘要】 目的 观察 livin 基因在急性白血病(al)病人白血病细胞中的表达及其临床意义。方法 采用半定量逆转录聚合酶链反应(rtpcr)方法检测41例不同时期al病人白血病细胞livin mrna的表达水平，以10例健康人作为正常对照。结果 al病人白血病细胞livin mrna 阳性表达率为53.7%。其中急性淋巴细胞白血病(all)和急性非淋巴细胞白血病(anll)病人livin mrna 阳性表达率分别为53.8%、53.6%，二者比较差异无显著性，但均高于正常对照组(10.0%)(p=0.035、0.017)。初治和复发al病人白血病细胞livin mrna 阳性表达率分别为52.4%、85.7%，明显高于对照组(p=0.025、0.004)。缓解组病人livin mrna阳性表达率为15.4%，明显低于初治组和复发组(p=0.004、0.030)，而与对照组相比差异无统计学意义。白细胞计数≥50×109/l的初治白血病病人livin mrna的阳性表达率(77.8%，7/9)明显高于白细胞计数<50×109/l的初治病人(25.0%，3/12)(p=0.022)，其表达水平也明显高于后者(t=6.50，p<0.05)。WwW.133229.CoM结论 livin mrna过度表达参与了al的发病，可作为al的诊断、复发及预后判断的指标之一。livin mrna表达在al细胞的增殖分化和(或) 抗凋亡过程中发挥了重要作用，可能是导致al细胞对化疗药物不敏感的原因之一，可作为治疗的一个潜在靶点。
【关键词】 livin 基因;白血病;逆转录聚合酶链反应
the expression of livin gene in acute leukemia and its clinical significance l tao, guan hongzai (department of hematology, qingdao university medical college, qingdao 266021, china); [abstract] objective to explore the correlation between the expression of livin gene in acute leukemic (al) cells and its clinical significance. methods the levels of leukemic cell livin mrna in 41 al patients and 10 healthy controls were measured by semiquantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (rtpcr) technique. results the positive expression rate of leukemic cell livin mrna in the patients was 53.7%, and that of livin mrna in all cells and anll cells were 53.8% and 53.6%, respectively, the difference between them was not significant, but higher than that in normal controls (10.0%) (p=0.035,0.017). the expression of livin mrna in initiallytreated al patients and the recurrent was 52.4% and 85.7%, respectively, which was significantly higher than that in normal controls (p=0.025,0.004). the expression of livin mrna in patients at remission was 15.4%, which was lower than that in initiallytreated and recurrent patients (p=0.004,0.030), but there was no statistical significance as compared with normal controls. besides, the initiallytreated al patients with a leukocyte count of at least 50×109 /l had a significantly higher livin mrna expression rate (77.8%,7/9) than that with a leukocyte count of less than 50×109 /l (25.0%,3/12) (p=0.022). in addition, the level of livin mrna in the former was significantly higher than that of the latter (t=6.50,p<0.05). conclusion overexpression of livin mrna involves in the pathogenesis of acute leukemia, which can be used as one of the parameters in the diagnosis, prediction of recurrence and prognosis of the disease. the expression of livin mrna plays an important effect on the proliferation and differentiation of al cells, which may be one of the reasons leading to insensitive to chemotherapy of al cells and be used as a potential target for the treatment of the disease.
[key words] livin gene; leukemia; reverse transcriptase polymerase chain reaction
凋亡抑制是肿瘤细胞的一个普遍特性。近年发现的凋亡蛋白抑制因子(iap)是一类重要的抗细胞凋亡因子，与肿瘤的发生发展关系密切。目前，人类iaps家族中已发现有niap、xiap、clap1、clap2、survivin、apollon、ilp2和livin共8个成员，其抗凋亡功能远强于bc12家族，在肿瘤的发病机制中起着重要作用。其中clap1、clap2、survivin等多个iap家族成员在白血病细胞中高表达，且与预后相关[13]。livin是iaps家族中的一个新成员，有2种异构体(livin α和livin β)，特异性表达于人的胚胎组织及大多数人类实体瘤组织，在分化成熟的正常组织中无表达或低表达[46]，在肿瘤组织中表达明显增高，与肿瘤的发生密切相关，可能成为肿瘤基因诊断和治疗的新靶点[7]。本研究旨在观察livin 基因在各类急性白血病(al)病人中表达水平的变化，并探讨其临床应用价值。
1 对象与方法
1.1 研究对象
al病人41例，男16例，女25例;年龄19～80 岁，中位年龄52 岁。其中急性非淋巴细胞白血病(anll) 28例(m2者10例，m3者4例，m4者6例，m5者8例)，急性淋巴细胞白血病(all) 13例(l1型 5例,l2型 8例)。初治病人21例，复发7例，缓解13例。缓解病人中2例系由初诊病人转化而来。所有初诊all 病人采用vdp(长春新碱、柔红霉素、泼尼松) 或vdcp(长春新碱、柔红霉素、环磷酰胺、泼尼松) 化疗方案诱导治疗;anll病人采用ha (高三尖杉酯碱、阿糖胞苷) 或da (柔红霉素、阿糖胞苷) 化疗方案治疗，m3 病人采用全反式维甲酸(atra) 或atra与三氧化二砷(as2o3)合用，或以atra 为主，联合应用小剂量da 或ha 方案诱导分化治疗。以上所有病人的诊断及治疗均参照张之南等[8]主编的《血液病诊断及疗效标准》。选择10例健康人作为正常对照，男4例，女6例;年龄21～57 岁，中位年龄41.5 岁。
1.2 标本处理
无菌操作取edta抗凝的骨髓液2 ml，ficol液(相对密度1.077) 分离单个核细胞，细胞比例大于80%，锥虫蓝拒染率大于99%，取约6 ×106个细胞，用pbs液洗涤2次，加trizol 液1 ml，混匀后-20 ℃保存，待提取rna。
1.3 细胞总rna提取
按invitrogen 公司试剂盒说明书的步骤操作。紫外线分光光度计测定rna 纯度(a260/a280>1.6)，同时进行rna 定量测定。在15 g/l琼脂糖凝胶上电泳可见3条清晰亮带，说明所提取rna完整。
1.4 cdna合成
取rna 5 μg，oligo (dt) primer(0.5 g/l)1 μl，用depc 处理水补至12 μl，于70 ℃下放置5 min。冰上骤冷后，加5×缓冲液4 μl，rna 酶抑制剂20 u，10 mmol/l dntps 2 μl，37 ℃ 5 min后加入revertaid mmulv逆转录酶 200 u，反应体系20 μl，42 ℃反应1 h，70 ℃下放置10 min终止反应。
1.5 pcr 扩增
1.5.1 引物设计 实验中所用引物根据genbank 提供的livin mrna 序列(livin α nm_139317.1;livin β nm_022161.2)，由上海生工公司设计合成。livin α 正义链： 5′tgtcagttcctgctccggtcaa3′，反义链：5′cgcacggcacaaagacgatg3′，其目的基因的长度为298 bp。livin β正义链：5′tgggaagaaccggaagac3′，反义链：5′cacggcacaaagacgatg3′，其目的基因的长度为263 bp。βactin正义链： 5′ctgggacgacatggagaaaa3′，反义链： 5′aaggaaggctggaagagtgc3′，目的基因长度为500 bp。
1.5.2 pcr反应 pcr反应体系包括：20 μmol/l的livin 正、反义链引物各0.5 μl，10 mmol/l的dntps 1.6 μl，10 ×缓冲液2 μl，taq dna 聚合酶1 u，rt 产物1 μl，其余以depc水补足至20 μl。预实验确定产物与循环之间呈线性关系。pcr 条件：95 ℃预变性5 min，1个循环;然后94 ℃变性30 s，59 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环;最后72 ℃延伸10 min。同时行βactin 测定作为内参照。
1.6 pcr 产物分析
取pcr 产物10 μl 与loading buffer 2 μl混合，在15 g/l 琼脂糖凝胶中电泳，80 v、25 min。阳性结果可见500、298和263 bp 处各有一条亮带，分别为βactin、livin α和livin β。紫外线透射仪观察并照相，照片经metamorph imaging sight软件进行分析并读取吸光度值，取livin/βactin 吸光度比值进行半定量，代表mrna表达水平。各标本重复2 次，取平均值。
1.7 统计学处理
用spss 11.5 和ppms 1.5[9]统计软件进行统计学处理。实验数据以率和中位数(四分位数间距)表示，组间比较采用χ2检验、fisher’s精确概率检验或秩和检验。
2 结 果
2.1 al细胞中livin mrna的表达
41例al病人白血病细胞livin mrna 阳性表达率为53.7%(22/41)。其中all 病人的阳性表达率为53.8%(7/13)，anll病人阳性表达率为53.6%(15/28)，二者均高于对照组的10% (1/10)，差异有统计学意义(p=0.035、 0.017)。但all与anll 比较无统计学差异。all、anll病人及对照组livin/βactin的半定量结果分别为0.171 (0.102)、0.087(0.117)、0.010(0.007)，all与anll 病人livin mrna 表达水平均高于对照组(h=20.22，d=14.25、14.61，p<0.05)。图1为部分病人的电泳结果。
m：marker;①、②同一初治病人livin α、β;③、④同一缓解病人livin α、β;⑤、⑥同一复发病人livin α、β;⑦、⑧正常对照。
图1 不同阶段白血病病人livin mrna的表达
2.2 al病人不同时期livin mrna的表达
初治组和复发组病人livin阳性表达率分别为52.4%(11/21)、85.7%(6/7)，均高于对照组(p=0.025、0.004)。缓解组病人livin阳性表达率为15.4%(2/13)，明显低于初治组和复发组病人(p=0.004、0.030)，缓解组与对照组相比差异无统计学意义。
2.3 livin mrna 表达与外周血白细胞计数关系
将初治白血病病人按白细胞计数分为两组，白细胞计数≥50×109/l的白血病病人livin mrna阳性表达率(77.8%，7/9)，明显高于白细胞计数<50×109/l的病人(25.0%，3/12)(p=0.022);两组livin/βactin 半定量结果分别为0.086(0.389)、0.038(0.298)，前者表达水平也明显高于后者(t=6.50，p<0.05)。
3 讨 论
iaps家族已发现8个成员，是独立于bcl2的抗凋亡蛋白。iaps的抗凋亡作用主要通过抑制凋亡蛋白酶的活性而实现。
livin是lin等[6]根据iaps同源序列，采用含有bir序列的est克隆，在人胚肾cdna文库中发现的一个iaps 家族的新成员。2001年 ashhab等[5]明确了livin存在2个不同的异构体livin α和livin β，分别由298和280个氨基酸组成。基因定位于染色体20q13.3。livin主要存在于细胞质中[56]。 livin抑制细胞凋亡作用主要通过其bir区与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspases)结合，抑制caspases3/7和caspases9的活性，达到阻断凋亡受体及以线粒体为基础的凋亡途径而起作用[6]。有研究报道livin 还可能通过分解smac，阻止其对xiap的拮抗作用，从而间接抑制caspase来调控凋亡[10]。由于livin α和livin β两种亚型结构上的差异，体外研究发现它们表现出不同的抗凋亡活性，虽然两者都能阻断tnfα与抗cd95抗体所诱导的细胞凋亡，但在阻断依托泊甙等降解dna的抗癌药物所诱导的细胞凋亡中，livin β比livin α有更强的阻断能力[1113]。
livin在胎儿发育过程中的多种组织高表达，在正常成人的大多数终末组织中(除胎盘)低表达或不表达[45]， 而在如黑色素瘤、乳癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌等多种恶性肿瘤组织中高表达[1112]。
abe 等[13]的研究显示，livin 在骨髓增生异常综合征(mds) 及初治急性髓系白血病(aml) 中表达均明显高于正常对照组，提示livin在初治白血病中可抑制凋亡。本文结果表明，大部分al 病人表达livin mrna，而且livin mrna表达阳性率和表达水平在al病人中均明显高于正常对照组，认为livin的异常高表达与al的发病有密切关系，与有关文献报道一致[13]。本研究还对不同类型al进行分析，结果显示all 和 anll中livin mrna的表达均高于正常对照组，各个亚型之间并无明显差异，推测livin mrna的过表达有可能是各类al的共同发病机制。本文结果还显示，初治及复发白血病病人livin mrna表达率高于对照组，而缓解组与对照组无差别，说明livin 表达在al细胞的增殖分化和(或) 抗凋亡过程中发挥了重要作用。本研究还显示，livin的表达水平在外周血白细胞数≥50×109/l的病人中高表达，而外周血白细胞数升高是al预后不良的重要因素。因此，livin可以作为判断预后的重要指标之一。livin的高表达是造成白血病细胞耐药的又一重要因素，具体作用机制有待于进一步研究。
有研究结果显示，livin过表达是白血病细胞耐药的根本原因[14]。本文结果也显示，livin mrna 在初治al病人表达率明显高于正常对照组，治疗缓解后其表达率明显下降，复发后表达率又再次升高，其原因可能与livin高表达后造成白血病细胞对化疗药物的敏感性下降有关。目前已有研究结果显示，采用rna干扰技术对livin基因表达进行干预后，细胞对诱导凋亡的药物和射线的敏感性增加[11]。由此可见，livin基因有可能成为白血病治疗的一个潜在靶点。
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