流式细胞技术论文参考文献

前言

细胞凋亡通常称为细胞程序性死亡，是由基因控制的主动性细胞死亡过程。越来越多数据发现，细胞凋亡与多种疾病密切相关，如癌细胞具有连续增殖、抵抗细胞凋亡能力，利用流式细胞仪分析细胞凋亡可为肿瘤诊断，疗效评价和预后预测提供了重要的参考指标。然而很多实验的同学们，常会碰到上机检测时细胞死亡太多却检测不出凋亡，多次重复结果不一致等现象，本文就一起看看如何把细胞凋亡的数据变的更加漂亮，准确！

首先，明确一下细胞凋亡和坏死的区别

细胞凋亡(apoptosis) 是一件主动性细胞死亡事件，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控，是细胞为更好地适应环境而主动争取的一种死亡过程。 具体表现为： 出芽形成凋亡小体、核小体间DNA的切割，凋亡小体被吞噬和消化等几个连续过程等[1]（如下图所示）。

图1：细胞凋亡的发生过程[1]

细胞坏死（necrosis） 则是一件被动的过程，是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程，即病理条件下，自体损伤的一种现象。 具体表现为： 细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，会引起局部严重的炎症反应（如下图所示）。

图2：细胞坏死的发生过程[1]

一、流式检测细胞凋亡的原理

Annexin V和PI双染法是流式检测细胞凋亡的经典方法 ，它是基于凋亡的早期细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine, PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面这一原理来实现的（如下图3）。

图3：凋亡早期 PS从细胞膜的内侧外翻

该方法简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，具体原理如下：

因此，将Annexin V与PI联合使用时，便可用来鉴别活细胞，凋亡细胞及死亡细胞。

二、实验操作步骤

三、数据分析

Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒是用FITC标记的Annexin V作为探针，FITC最大激发波长为488 nm，最大发射波长525 nm，FITC的绿色荧光在FL1通道检测；PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm，最大发射波长为615 nm，PI的红色荧光在FL2或FL3通道检测。通过软件分析，绘制双色散点图，FITC为横坐标，PI为纵坐标。

如下图所示：细胞可以分为4个象限：

图4：4个象限的细胞分布图

举例：如常用于研究药物或者基因等对细胞凋亡的影响。 通过比较Control组和药物组，发现化合物可以诱导前列腺癌细胞系PC-3M的细胞凋亡，处理组（20μM）的晚期凋亡细胞比例与Control组（0μM）相比，从1.79%上升到11.39%。进而还可根据每个象限的数据计算出活细胞、凋亡细胞和坏死细胞百分率。

图5. 药物浓度梯度依赖性的诱导PC-3M细胞凋亡[2]

四、常见问题解答

1. 如何避免出现假阳性结果？

2. 为什么必须收集细胞上清？

因为凋亡的细胞可能会脱壁，悬浮于培养基，所以必须收集上清再离心取沉淀，合并胰酶消化下来的细胞，不然检测出来的凋亡比例可能会减少。

3. 为什么在染色后1h内就要上机检测？

由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析；PI受时间的影响很大，因标记了PI后会加大细胞毒性，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显加大，所以建议在一个小时内检测。

4. 其他注意事项

参考文献：

[1]Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 2007;35:495-516.

[2]Qin M, Peng S, Liu N, et al. LG308, a Novel Synthetic Compound with Antimicrotubule Activity in Prostate Cancer Cells, Exerts Effective Antitumor Activity.[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2015,355(3): 473-483.

在2019年的三月份我正式开始做单细胞相关研究工作，有趣的同时也是朋友我们经常误会的是：你是不是用流式细胞术？而我在得知自己要做这单细胞（single cell ）的研究时，在Google搜关键词（single cell ），居然有不少是介绍流式细胞术的。流式细胞术应用到高通量测序领域就变成了微流控技术。可见，把生命科学的视界拉倒单细胞水平的比高通量测序更早的是流式细胞术。

那么在单细胞测序技术出现之前，人们在研究单细胞的时候都是怎么做的呢，都有哪些分析点呢？单细胞测序技术给单细胞研究带来了哪些新的视角？这一切的答案都要求我们对流式细胞术有一个基本的了解。

流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。

流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。

采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。

（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统

激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）

测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。

荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 线性放大器和对数放大器

通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。

FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少

单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析

双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。

双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。

由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。

流式细胞仪(FCM)是集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。

①细胞生物学 ：细胞凋亡研究；定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析，并可纯化X或Y染色体。 [详细]

②肿瘤学 ：DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用DNA倍体测定技术，对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。 [详细]

③免疫学 ：研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系；进行免疫活性细胞的分型与纯化；分析淋巴细胞亚群与疾病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等。 [详细] ④血液学 ：血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等；用NBT及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细胞，以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血；检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病，如红斑狼疮等。 [详细]

⑤药物学 ：检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等。 [详细]

细胞凋亡研究 ：细胞凋亡是细胞在基因控制下的有序死亡，在疾病发生、发展中有重要作用，因而研究细胞凋亡有重要意义。细胞凋亡检测方法很多，应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定。 [详细]

** 细胞分选**：流式细胞仪能够分选某一亚群细胞,分选纯度＞95%。目前细胞分选主要用于研究，临床应用较少。利用流式细胞仪分选免疫担当细胞进行细胞免疫学研究也是目前的热门课题。流式细胞仪能够分选出你想得到的任何一亚群细胞，只要你想得到的某一亚群细胞有合适的单克隆抗体标记。 [详细]

** 细胞因子的检测**：随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。本文主要对胞内细胞因子流式细胞技术作介绍。 [详细]

** 血液学应用**：本文向您介绍流式细胞仪在血液研究领域的应用，包括DNA倍体分析及细胞周期分析，淋巴细胞亚群测定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，红细胞疾病诊断，血小板功能分析和血小板病诊断，微小残留白血病检测，白细胞吞噬功能测定，NK和LAK细胞活性测定，造血干/祖细胞测定等。 [详细]