细胞癌变论文参考文献

1. 细胞背景： HCT116细胞是由M·Brattain等人于1979年从一位患结直肠癌的48岁男性病人中分离得到的。该细胞在半固体琼脂糖培养基中形成克隆，在无胸腺裸鼠中有致瘤性，形成上皮样的肿瘤，属于上皮样贴壁生长的肿瘤细胞系。 2. 应用范围和前景： 结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的消化道恶性肿瘤之一，在恶性肿瘤中发病率位居第三，死亡率位居第二，根据 GLOBOCAN 数据显示，2018 年全球结直肠癌新增 185 万例，约 88 万人死亡，给人类健康带来了巨大威胁。[1]因此，研究结直肠癌的发病机制以及治疗手段对临床诊断和治疗结直肠癌具有十分重要的意义。目前，在药物开发的最初级阶段即细胞生物学水平的鉴定中，HCT166细胞已成为结直肠癌研究领域中被广泛使用的模式细胞，具体应用举例如下： （1） 探究药物影响结直肠癌细胞增殖，迁移和侵袭的机制。例如：PPARα在白霉素处理的HCT116细胞迁移活性及CYP2S1和CYP1B1的表达中起重要作用[2] （2） 探究药物影响结直肠癌细胞生长的体外作用机制，如细胞凋亡和细胞周期改变等。例如：Raddeanin A通过PI3K/AKT通路调控人HCT116细胞凋亡和周期阻滞[3] （3） 探究药物对结直肠癌治疗的敏感性和耐药性。例如：Doxorubicin抑制HCT116细胞中miR-140的表达而上调PD-L1，从而使肿瘤细胞对药物产生耐药性[4] （4） 开发新的癌相关信号通路，为临床治疗结直肠癌提供指导：例如，研究Notch和Wnt信号通路在结直肠癌细胞HCT116耐药中的意义等[5] （5） 开发LncRNA和miRNA在结直肠癌治疗中的新途径。例如：在HCT116细胞中，YWHAE长链非编码RNA通过激活K-Ras/Erk1/2和PI3K/Akt信号通路与miR-323a-3p和miR-532-5p竞争，为结直肠癌的治疗提供新的靶位点[6] 如上所述，HCT116细胞在结肠癌的各种机制都具有重要的研究价值，而最基本的研究思路一般都从分子层面即基因或蛋白开始，因此CRISPR/Cas9技术的身影也就理所当然地出现在许多研究课题中，毕竟它在研究致癌相关的单基因功能中有着无可替代的优势。 如发现TRPM4在人结直肠癌中高表达，似乎与结直肠癌细胞的增殖、细胞周期和侵袭有关，通过在HCT116细胞中利用CRISPR/Cas9技术对TRPM4基因敲除后发现肿瘤细胞的迁移和侵袭的确都降低了，同时伴随着细胞周期的改变[7]； 以及Cell报道利用CRISPR/Cas9技术，将野生型KRAS替换为突变型使得杂合突变的HCT116细胞对药物治疗更为敏感[8]； 再如利用CRISPR/Cas9技术对HCT116细胞中的Tks4基因敲除，表现出显著的上皮间质转化，细胞运动增加，细胞间的粘附程度降低，发现Tks4基因在EMT调控和肿瘤发展中发挥重要作用[9]； 发现CTC1L1142H突变导致端粒酶维持受损，研究人员利用CRISPR/Cas9技术对HCT116细胞中的CTC1点突变，证实了CTC1:STN1相互作用为抑制端粒酶活性所必需[10]。 可以看出，研究人员对于CRISPR/Cas9技术的青睐是毋庸置疑的，源井生物提供的CRISPR/Cas9技术服务也为众多科研人员解决了实验难题，如细胞基因敲除不彻底、细胞基因敲入不稳定等等，让更多科研人员能顺利实现他们的科研目标。 1. 基因点突变[11] Hiroyuki Kato等研究者利用CRISPR/Cas9技术在HCT116细胞中突变了UTX基因第137和138位氨基酸：G137V和 G137VΔ138，发现原本表达于细胞核的野生型UTX，在两种突变株的细胞核中表达量大大降低了，而在细胞质中的表达增加了，如图A-C所示：A,B为免疫荧光图片，C为Western Blot结果；免疫共沉淀的结果如图D所示，这是一种新的UTX调控机制，文章中还进一步揭示了UTX与MLL3/4复合物（ASH2L, PTIP and PA1是MLL3/4复合物的成分）相互作用在癌症形成中的重要性。 2. 基因敲除[12] Sara Steinmann等人利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了DAPK1缺失型的HCT116单克隆细胞系，最终揭示了DAPK1对结直肠癌侵袭性的影响。 经过Western Blot验证，Sara Steinmann等人得到了三种DAPK1基因敲除型单克隆细胞（如图A所示）。免疫荧光实验检测pERK1/2主要位于野生型HCT116细胞质，然而在三种基因敲除型细胞中，pERK1/2均在细胞核中显著表达。（如图B所示） 由于绒毛膜尿囊膜模型（CAM）实验是血管生成的经典体内模型，研究人员将DAPK1基因敲除型克隆和野生型HCT116细胞移植到鸡CAM上，并在蛋中培养5天，发现DAPK1的缺失导致CAM体内生长模式的改变和肿瘤出芽的增强(如图C所示) 此外，该研究团队利用大鼠脑3D体外模型发现肿瘤细胞在鸡胚胎器官中有更多的扩散，并且侵袭能力也增强了。DAPK缺失型HCT116细胞表现出更多的弥散性肿瘤细胞，并优先在鸡胚的肝、心、脑中积累（如图D所示）。最后，研究人员发现DAPK1-ERK1信号通路参与了CRC的转移过程(如图E所示)。 3. 基因敲入[13] Bax是促凋亡Bcl-2基因家族成员之一，在线粒体依赖的凋亡起始中发挥重要作用，R Peng等研究人员在BAX-KO HCT116细胞中敲入了5种位于Bax基因上且与Bcl-2其它成员有相互作用的突变位点。 已有文献报道BAX-KO HCT116细胞在一种甾醇类药物 sulindac的刺激下并不会发生凋亡，而R Peng等研究人员发现在BAX-KO HCT116细胞中敲入WT BAX能恢复sulindac和TRAIL引起的HCT116细胞凋亡；敲入K21E和D33A突变，Bax介导的凋亡被完全恢； 敲入D68R和 S184V突变只恢复了一部分，而敲入L70A/D71A突变恢复药物引起的凋亡程度更低。 该研究是在目的基因敲除了的目的细胞的基础上，再进行含有突变位点的目的基因敲入以及WT目的基因敲入（作为对照），便可清晰地了解目的基因表达的蛋白和与之相互作用的其它蛋白间相互作用的特定位点关系，是一个验证通过生物信息学分析得到的预测位点是否在蛋白质相互作用中真实起作用的好方法。因此，源井生物也为科研人员提供了相应的服务便利，在享受细胞基因敲入服务的同时，还会得到我们赠送的基因敲除细胞，满足科研人员的各种研究需求。 参考文献 : [1] Bray, Freddie et al. “Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.” CA: a cancer journal for cliniciansvol. 68,6 (2018): 394-424. doi:10.3322/caac.21492[2] Khor CY, Khoo BY. PPARα plays an important role in the migration activity, and the expression of CYP2S1 and CYP1B1 in chrysin-treated HCT116 cells. Biotechnol Lett. 2020;42(8):1581-1595. doi:10.1007/s10529-020-02904- [3] Meng C, Teng Y, Jiang X. Raddeanin A Induces Apoptosis and Cycle Arrest in Human HCT116 Cells through PI3K/AKT Pathway Regulation In Vitro and In Vivo. Evid Based Complement Alternat Med. 2019;2019:7457105. Published 2019 May 26. doi:10.1155/2019/7457105 [4] Naba NM, Tolay N, Erman B, Sayi Yazgan A. Doxorubicin inhibits miR-140 expression and upregulates PD-L1 expression in HCT116 cells, opposite to its effects on MDA-MB-231 cells. Turk J Biol. 2020;44(1):15-23. Published 2020 Feb 17. doi:10.3906/biy-1909-12 [5] Kukcinaviciute, Egle et al. “Significance of Notch and Wnt signaling for chemoresistance of colorectal cancer cells HCT116.” Journal of cellular biochemistry vol. 119,7 (2018): 5913-5920. doi:10.1002/jcb.26783 [6] Bjeije, Hassan et al. “YWHAE long non-coding RNA competes with miR-323a-3p and miR-532-5p through activating K-Ras/Erk1/2 and PI3K/Akt signaling pathways in HCT116 cells.” Human molecular genetics vol. 28,19 (2019): 3219-3231. doi:10.1093/hmg/ddz146 [7] Kappel, Sven et al. “TRPM4 is highly expressed in human colorectal tumor buds and contributes to proliferation, cell cycle, and invasion of colorectal cancer cells.” Molecular oncology vol. 13,11 (2019): 2393-2405. doi:10.1002/1878-0261.12566 [8] Szeder, Bálint et al. “Absence of the Tks4 Scaffold Protein Induces Epithelial-Mesenchymal Transition-Like Changes in Human Colon Cancer Cells.” Cells vol. 8,11 1343. 29 Oct. 2019, doi:10.3390/cells8111343 [9] Burgess, Michael R et al. “KRAS Allelic Imbalance Enhances Fitness and Modulates MAP Kinase Dependence in Cancer.” Cell vol. 168,5 (2017): 817-829.e15. doi:10.1016/j.cell.2017.01.020 [10] Gu, Peili et al. “CTC1-STN1 coordinates G- and C-strand synthesis to regulate telomere length.” Aging cell vol. 17,4 (2018): e12783. doi:10.1111/acel.12783 [11] Kato, Hiroyuki et al. “Cancer-derived UTX TPR mutations G137V and D336G impair interaction with MLL3/4 complexes and affect UTX subcellular localization.” Oncogene vol. 39,16 (2020): 3322-3335. doi:10.1038/s41388-020-1218-3 [12] Steinmann, Sara et al. “DAPK1 loss triggers tumor invasion in colorectal tumor cells.” Cell death & disease vol. 10,12 895. 26 Nov. 2019, doi:10.1038/s41419-019-2122-z [13] Peng, R et al. “Targeting Bax interaction sites reveals that only homo-oligomerization sites are essential for its activation.” Cell death and differentiation vol. 20,5 (2013): 744-54. doi:10.1038/cdd.2013.4

分子生物学(molecular biology) 在分子水平上研究生命现象的科学。研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结 构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。研究内容包括各种生命过程如光合作用、发育的分子机制、神经活动的机理、癌的发生等。 从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。自20世纪50年代以来，分子生物学是生物学的前沿与生长点，其主要研究领域包括蛋白质体系、蛋白质-核酸体系 (中心是分子遗传学)和蛋白质-脂质体系（即生物膜）。 生物大分子，特别是蛋白质和核酸结构功能的研究，是分子生物学的基础。现代化学和物理学理论、技术和方法的应用推动了生物大分子结构功能的研究，从而出现了近30年来分子生物学的蓬勃发展。分子生物学和生物化学及生物物理学关系十分密切，它们之间的主要区别在于：①生物化学和生物物理学是用化学的和物理学的方法研究在分子水平，细胞水平，整体水平乃至群体水平等不同层次上的生物学问题。而分子生物学则着重在分子（包括多分子体系）水平上研究生命活动的普遍规律；②在分子水平上，分子生物学着重研究的是大分子，主要是蛋白质，核酸，脂质体系以及部分多糖及其复合体系。而一些小分子物质在生物体内的转化则属生物化学的范围；③分子生物学研究的主要目的是在分子水平上阐明整个生物界所共同具有的基本特征，即生命现象的本质；而研究某一特定生物体或某一种生物体内的某一特定器官的物理、化学现象或变化，则属于生物物理学或生物化学的范畴。 发展简史 结构分析和遗传物质的研究在分子生物学的发展中作出了重要的贡献。结构分析的中心内容是通过阐明生物分子的三维结构来解释细胞的生理功能。1912年英国 W.H.布喇格和W.L.布喇格建立了X射线晶体学，成功地测定了一些相当复杂的分子以及蛋白质的结构。以后布喇格的学生W.T.阿斯特伯里和J.D.贝尔纳又分别对毛发、肌肉等纤维蛋白以及胃蛋白酶、烟草花叶病毒等进行了初步的结构分析。他们的工作为后来生物大分子结晶学的形成和发展奠定了基础。50年代是分子生物学作为一门独立的分支学科脱颖而出并迅速发展的年代。首先是在蛋白质结构分析方面，1951年L.C.波林等提出了 α-螺旋结构，描述了蛋白质分子中肽链的一种构象。1955年F.桑格完成了胰岛素的氨基酸序列的测定。接着 J.C.肯德鲁和M.F.佩鲁茨在X射线分析中应用重原子同晶置换技术和计算机技术分别于1957和1959年阐明了鲸肌红蛋白和马血红蛋白的立体结构。1965年中国科学家合成了有生物活性的胰岛素，首先实现了蛋白质的人工合成。 另一方面，M.德尔布吕克小组从1938年起选择噬菌体为对象开始探索基因之谜。噬菌体感染寄主后半小时内就复制出几百个同样的子代噬菌体颗粒，因此是研究生物体自我复制的理想材料。1940年G.W.比德尔和E.L.塔特姆提出了“一个基因，一个酶”的假设，即基因的功能在于决定酶的结构，且一个基因仅决定一个酶的结构。但在当时基因的本质并不清楚。1944年O.T.埃弗里等研究细菌中的转化现象，证明了DNA是遗传物质。1953年J.D.沃森和F.H.C.克里克提出了DNA的双螺旋结构，开创了分子生物学的新纪元。在此基础上提出的中心法则，描述了遗传信息从基因到蛋白质结构的流动。遗传密码的阐明则揭示了生物体内遗传信息的贮存方式。1961年F.雅各布和J.莫诺提出了操纵子的概念，解释了原核基因表达的调控。到20世纪60年代中期，关于DNA自我复制和转录生成RNA的一般性质已基本清楚，基因的奥秘也随之而开始解开了。 仅仅30年左右的时间，分子生物学经历了从大胆的科学假说，到经过大量的实验研究，从而建立了本学科的理论基础。进入70年代，由于重组DNA研究的突破，基因工程已经在实际应用中开花结果，根据人的意愿改造蛋白质结构的蛋白质工程也已经成为现实。 基本内容 蛋白质体系 蛋白质的结构单位是α-氨基酸。常见的氨基酸共20种。它们以不同的顺序排列可以为生命世界提供天文数字的各种各样的蛋白质。 蛋白质分子结构的组织形式可分为 4个主要的层次。一级结构，也叫化学结构，是分子中氨基酸的排列顺序。首尾相连的氨基酸通过氨基与羧基的缩合形成链状结构，称为肽链。肽链主链原子的局部空间排列为二级结构。二级结构在空间的各种盘绕和卷曲为三级结构。有些蛋白质分子是由相同的或不同的亚单位组装成的，亚单位间的相互关系叫四级结构。 蛋白质的特殊性质和生理功能与其分子的特定结构有着密切的关系，这是形形色色的蛋白质所以能表现出丰富多彩的生命活动的分子基础。研究蛋白质的结构与功能的关系是分子生物学研究的一个重要内容。 随着结构分析技术的发展，现在已有几千个蛋白质的化学结构和几百个蛋白质的立体结构得到了阐明。70年代末以来，采用测定互补DNA顺序反推蛋白质化学结构的方法，不仅提高了分析效率，而且使一些氨基酸序列分析条件不易得到满足的蛋白质化学结构分析得以实现。 发现和鉴定具有新功能的蛋白质，仍是蛋白质研究的内容。例如与基因调控和高级神经活动有关的蛋白质的研究现在很受重视。 蛋白质－核酸体系 生物体的遗传特征主要由核酸决定。绝大多数生物的基因都由 DNA构成。简单的病毒，如λ噬菌体的基因组是由 46000个核苷酸按一定顺序组成的一条双股DNA（由于是双股DNA，通常以碱基对计算其长度）。细菌，如大肠杆菌的基因组，含4×106碱基对。人体细胞染色体上所含DNA为3×109碱基对。 遗传信息要在子代的生命活动中表现出来，需要通过复制、转录和转译。复制是以亲代 DNA为模板合成子代 DNA分子。转录是根据DNA的核苷酸序列决定一类RNA分子中的核苷酸序列；后者又进一步决定蛋白质分子中氨基酸的序列，就是转译。因为这一类RNA起着信息传递作用，故称信使核糖核酸(mRNA)。由于构成RNA的核苷酸是4种，而蛋白质中却有20种氨基酸，它们的对应关系是由mRNA分子中以一定顺序相连的 3个核苷酸来决定一种氨基酸，这就是三联体遗传密码。 基因在表达其性状的过程中贯串着核酸与核酸、核酸与蛋白质的相互作用。DNA复制时，双股螺旋在解旋酶的作用下被拆开，然后DNA聚合酶以亲代DNA链为模板，复制出子代 DNA链。转录是在 RNA聚合酶的催化下完成的。转译的场所核糖核蛋白体是核酸和蛋白质的复合体，根据mRNA的编码，在酶的催化下，把氨基酸连接成完整的肽链。基因表达的调节控制也是通过生物大分子的相互作用而实现的。如大肠杆菌乳糖操纵子上的操纵基因通过与阻遏蛋白的相互作用控制基因的开关。真核细胞染色质所含的非组蛋白在转录的调控中具有特殊作用。正常情况下，真核细胞中仅2～15％基因被表达。这种选择性的转录与转译是细胞分化的基础。 蛋白质－脂质体系 生物体内普遍存在的膜结构，统称为生物膜。它包括细胞外周膜和细胞内具有各种特定功能的细胞器膜。从化学组成看，生物膜是由脂质和蛋白质通过非共价键构成的体系。很多膜还含少量糖类，以糖蛋白或糖脂形式存在。 1972年提出的流动镶嵌模型概括了生物膜的基本特征：其基本骨架是脂双层结构。膜蛋白分为表在蛋白质和嵌入蛋白质。膜脂和膜蛋白均处于不停的运动状态。 生物膜在结构与功能上都具有两侧不对称性。以物质传送为例，某些物质能以很高速度通过膜，另一些则不能。象海带能从海水中把碘浓缩 3万倍。生物膜的选择性通透使细胞内pH和离子组成相对稳定，保持了产生神经、肌肉兴奋所必需的离子梯度，保证了细胞浓缩营养物和排除废物的功能。 生物体的能量转换主要在膜上进行。生物体取得能量的方式，或是像植物那样利用太阳能在叶绿体膜上进行光合磷酸化反应；或是像动物那样利用食物在线粒体膜上进行氧化磷酸化反应。这二者能量来源虽不同，但基本过程非常相似，最后都合成腺苷三磷酸。对于这两种能量转换的机制，P.米切尔提出的化学渗透学说得到了越来越多的证据。生物体利用食物氧化所释放能量的效率可达70％左右，而从煤或石油的燃烧获取能量的效率通常为20～40％，所以生物力能学的研究很受重视。对生物膜能量转换的深入了解和模拟将会对人类更有效地利用能量作出贡献。 生物膜的另一重要功能是细胞间或细胞膜内外的信息传递。在细胞表面，广泛地存在着一类称为受体的蛋白质。激素和药物的作用都需通过与受体分子的特异性结合而实现。癌变细胞表面受体物质的分布有明显变化。细胞膜的表面性质还对细胞分裂繁殖有重要的调节作用。 对细胞表面性质的研究带动了糖类的研究。糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂等生物大分子结构与功能的研究越来越受到重视。从发展趋势看，寡糖与蛋白质或脂质形成的体系将成为分子生物学研究的一个新的重要的领域。 理论意义和应用 分子生物学的成就说明：生命活动的根本规律在形形色色的生物体中都是统一的。例如，不论在何种生物体中，都由同样的氨基酸和核苷酸分别组成其蛋白质和核酸。遗传物质，除某些病毒外，都是DNA，并且在所有的细胞中都以同样的生化机制进行复制。分子遗传学的中心法则和遗传密码，除个别例外，在绝大多数情况下也都是通用的。 物理学的成就证明，一切物质的原子都由为数不多的基本粒子根据相同的规律所组成，说明了物质世界结构上的高度一致，揭示了物质世界的本质，从而带动了整个物理学科的发展。分子生物学则在分子水平上揭示了生命世界的基本结构和生命活动的根本规律的高度一致，揭示了生命现象的本质。和过去基本粒子的研究带动物理学的发展一样，分子生物学的概念和观点也已经渗入到基础和应用生物学的每一个分支领域，带动了整个生物学的发展，使之提高到一个崭新的水平。 过去生物进化的研究，主要依靠对不同种属间形态和解剖方面的比较来决定亲缘关系。随着蛋白质和核酸结构测定方法的进展，比较不同种属的蛋白质或核酸的化学结构，即可根据差异的程度，来断定它们的亲缘关系。由此得出的系统进化树，与用经典方法得到的是基本符合的。采用分子生物学的方法研究分类与进化有特别的优越性。首先，构成生物体的基本生物大分子的结构反映了生命活动中更为本质的方面。其次，根据结构上的差异程度可以对亲缘关系给出一个定量的，因而也是更准确的概念。第三，对于形态结构非常简单的微生物的进化，则只有用这种方法才能得到可靠结果。 高等动物的高级神经活动是极其复杂的生命现象，过去多是在细胞乃至整体水平上研究，近年来深入到分子水平研究的结果充分说明高级神经活动也同样是以生物大分子的活动为基础的。例如，在高等动物学习与记忆的过程中，大脑中RNA和蛋白质的组成发生明显的变化，并且一些影响生物体合成蛋白质的药物也显著地影响学习与记忆的能力。又如，“生物钟”是一种熟知的生物现象。用鸡进行的实验发现，有一种重要的神经传递介质（5-羟色胺）和一种激素（褪黑激素）以及控制它们变化的一种酶，在鸡脑中的含量呈24小时的周期性变化。正是这种变化构成了鸡的“生物钟”的物质基础。 在应用方面，生物膜能量转换原理的阐明，将有助于解决全球性的能源问题。了解酶的催化原理就能更有针对性地进行酶的人工模拟，设计出化学工业上广泛使用的新催化剂，从而给化学工业带来一场革命。 分子生物学在生物工程技术中也起了巨大的作用，1973年重组DNA技术的成功，为基因工程的发展铺平了道路。80年代以来，已经采用基因工程技术，把高等动物的一些基因引入单细胞生物，用发酵方法生产干扰素、多种多肽激素和疫苗等。基因工程的进一步发展将为定向培育动、植物和微生物良种以及有效地控制和治疗一些人类遗传性疾病提供根本性的解决途径。 从基因调控的角度研究细胞癌变也已经取得不少进展。分子生物学将为人类最终征服癌症做出重要的贡献。[编辑本段]分子生物学的应用 1，亲子鉴定 近几年来，人类基因组研究的进展日新月异，而分子生物学技术也不断完善，随着基因组研究向各学科的不断渗透，这些学科的进展达到了前所未有的高度。在法医学上，STR位点和单核苷酸（SNP）位点检测分别是第二代、第三代DNA分析技术的核心，是继RFLPs（限制性片段长度多态性）VNTRs（可变数量串联重复序列多态性）研究而发展起来的检测技术。作为最前沿的刑事生物技术，DNA分析为法医物证检验提供了科学、可靠和快捷的手段，使物证鉴定从个体排除过渡到了可以作同一认定的水平，DNA检验能直接认定犯罪、为凶杀案、强奸杀人案、碎尸案、强奸致孕案等重大疑难案件的侦破提供准确可靠的依据。随着DNA技术的发展和应用，DNA标志系统的检测将成为破案的重要手段和途径。此方法作为亲子鉴定已经是非常成熟的，也是国际上公认的最好的一种方法。