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水样中的细菌包括很多“属”和很多“种", 我国《生活饮用水卫生标准》2006版[ 1] 的卫生学评价标准是以菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群和大肠埃希氏菌4项作为微生物指标。 总大肠菌群可来自人类和温血动物的肠道及自然环境, 包含有埃希氏菌属、柠檬酸菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属等一大群在37℃经24小时培养能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。他们在伊红美蓝平板生长特征是：（1）深紫黑色、具有金属光泽；（2）紫黑色、不带或略带金属光泽；（3）淡紫红色菌落。 耐热大肠菌群，又称粪大肠菌群，主要包括埃希氏菌属和耐热克雷伯菌属[6],是利用提高温度的方法将大自然的大肠菌群和粪便中的大肠菌群区分开的，它是一群能在44.5 ℃下生长的大肠菌群，只有来源于动物和人类粪便的大肠菌群能生长，而来自大自然的大肠菌群不能耐热生长[8-9]。 大肠埃希氏菌(Escherichiacoli),以前常称大肠杆菌, 广泛存在于人类和温血动物的肠道中, 是人类和动物肠道中需氧性共生菌的优势菌群, 维持宿主健康部分生理功能必需的肠道菌.虽然大多数的大肠埃希氏菌为非致病菌, 但是当宿主免疫力降低或细菌侵入肠道的外组织或器官时, 可引起肠外感染。某些血清型可产生毒素, 为致病性大肠埃希氏菌, 可引起人类腹泻。所以生活饮用水中大肠埃希氏菌成为肠道疾病的重要致病菌之一。[2] 他们从属范围逻辑关系如下 《生活饮用水卫生标准》2006版标准, 增加了生活饮用水中大肠埃希氏菌的检验。 为了提高实验室检测能力，近日，本实验室开展了生活饮用水中大肠埃希氏菌检测的质控活动，质控活动达到如下目标： 一、使用工作中分离的耐热大肠菌群、标准菌株产气肠杆菌、标准菌株大肠埃希氏菌三种菌进行试验，观察不同大肠菌群在EC-MUG培养基荧光实况，取得阳性标本荧光视觉效果。 二、使用的试管进行酸浸泡、蒸馏水处理和水龙水直接清洗处理，寻找大肠埃希菌荧光效果影响因素。 三、使用北京陆桥EC-MUG培养基试剂及青岛海博EC-MUG培养基试剂进行比较试验，评价实验室常规使用的试剂是否优良。 1材料与仪器 1.1 EC-MUG培养基, 购自北京陆桥有限责任公司、青岛海博 1.2伊红美兰培养基, 购自北京陆桥有限责任公司。 1.3营养肉汤，购自北京陆桥有限责任公司。 1.4培养箱, 36℃ ±1℃;44.5±0.5℃;波长366nm紫外灯 2方法与结果 2.1方法原理 大肠埃希氏菌能特异性产生产生β -葡萄糖醛酸酶(β -glucuronidase), 此酶能分解培养基上的EC-MUG荧光底物释放出荧光产物, 使培养基在366 nm紫外光下产生特征性荧光, 以此技术来检测大肠埃希氏菌。 2.2操作步骤与结果 上图是产气肠杆菌与大肠埃希氏菌在EC-MUG培养基经44.5℃培养后，在日光灯背景下，产气肠杆菌液体清亮，说明产气肠杆菌在44.5℃中不能生长繁殖；大肠埃希氏菌液体混浊，说明大肠埃希氏菌在44.5℃中能生长繁殖。 对上述经培养过的EC-MUG培养基，在日光灯观察背景下，使用366nm紫外线灯进行观察。产气肠杆菌依然清亮，无蓝光；不同稀释度的大肠埃希氏菌菌液有明显的蓝光，蓝光间无明显差别。因此，在观察大肠埃希氏菌发酵效果时，可以在普通光线下，使用366nm紫外线灯进行观察，结果显著。 上图为在暗室下对前述经培养过的EC-MUG培养基观察实验效果。大肠埃希氏菌发酵后产生荧光，并且不同稀释度的菌液，目视无显著差别；与产气肠杆菌效果阴性效果有非常明显的差别。产气肠杆菌培养管有微弱荧光，可能存在EC-MUG培养基自身有荧光事实！ 该图是灭菌蒸馏水与EC-MUG培养基效果比对。1、2试管是泡酸清洗的试管，5、6为未泡酸清洗的试管。 在暗室下观察，产气肠杆菌在EC-MUG培养管相对于蒸馏水，用手机拍照有明显荧光，实际观察中，这种荧光相对弱些，但依然是有荧光产生。所以，普通试管及蒸馏水可能产生的荧光可以忽略不计，但试剂本身产生有一定量的荧光是实验事实。 因此，为了减少个人观察经验不足，建议，在实验过程中，应该带标进行比对观察，这样头脑中才有荧光阴阳直观效果。 上图中的耐热大肠菌群，是日常工作中检出的工作株，实验室证实他们在伊红美兰平板上能产生铁锈色样金属光泽的大肠菌群，属于耐热大肠菌群。目前该菌在EC-MUG培养基经44.5℃培养后中也能混浊生长。 在日光灯背景下用三用紫外灯366nm紫外线波观察，各个试管有微许蓝光，实际目视观察没有很强。手机拍照显示都有微量荧光效果，产气肠杆菌颜色似乎还更深点。可以判断全部10管试验管均为大肠埃希氏菌阴性。 上图为暗室下对产气肠杆菌和工作株的耐热大肠菌群在EC-MUG荧光效果图。手机拍照显示有较强荧光，实际目视效果较弱，如没有阳性对照比较，易误以为大肠埃希氏菌阳性结果。但在暗室下观察，该耐热大肠菌群、产气肠杆菌没有差别，也可以判断为结果阴性。 通过产气肠杆菌与实验室耐热大肠菌群在EC-MUG高温培养后的荧光效果比较。产气肠杆菌在高温中不能生长，液体清亮，也不能分解荧光底物。本实验室工作株耐热大肠菌群能在高温中生长，所以液体混浊，但本次工作菌株不分解分解培养基上的MUG荧光底物释放出荧光产物，通过与产气肠杆菌（商品标准菌株）比较，判定为荧光阴性，因此可能本实验室该耐热大肠菌群工作株是耐热克雷伯菌属。（耐热大肠菌群，又称粪大肠菌群，它由埃希氏菌属和耐热克雷伯菌属组成。非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语。） 以下图片为两种不同试剂用相同处理的试管进行EC-MUG培养观察效果： 暗室下观察荧光效果图，北京陆桥产品阴阳对照明显。 日光灯下，用紫外线灯观察荧光效果图，北京陆桥产品阴阳对照明显。 暗室下观察荧光效果图，青岛海博产品阴阳对照明显。 日光灯下，用紫外线灯观察荧光效果图，青岛海博产品阴阳对照明显。 上图为正常光线下的实验培养结果照片。 通过北京陆桥、青岛海博两种试剂的比较，两种试剂在不同方式处置的试管内培养大肠埃希氏菌，稀释倍数不同，产生的荧光效果是一样的。 3.讨论 3.1、有关文献及实验结果中，试管本身会产生微量荧光[3]。本次实验使用的试管分两部分，一部分是用酸浸泡试管七天以上，然后进行蒸馏水清洗；另一部分是直接用水龙头水直接清洗，两类试管均165℃2小时以上高温灭菌。两类试管分别均分装有蒸馏水对照、产气肠杆菌（标准菌株）、耐热大肠菌群（工作菌株）、大肠埃希氏菌株（标准菌株）。同一菌株在不同方法处置的试管，实验效果无差别，说明一般试管可能产生的荧光对实验没有影响。 3.2、EC-MUG培养基试剂本身经培养后会溢出一定的荧光物质，如果没有阳性对照作比较，可能会误以为是真阳性，造成假阳性结果。因此，初级实验者或日常工作中，应带标准菌株同步实验并观察实验结果。 3.3、两家试剂厂家生产的EC-MUG培养基，阳性结果产生荧光效果均显著，实际操作中，日常生活饮用水中的大肠埃希氏菌试验结果与阴性对照相差无异时，可以按未检出大肠埃希氏菌结果进行报告。 3.4、GB/T5750.12－2006检测大肠埃希氏菌有多管发酵法、滤膜法，大肠埃希氏菌酶底法。推荐的第一法为多管发酵法，是在检测总大肠菌发酵乳糖蛋白胨基础上，有选择地进行EC-MUG培养，从批量工作中，减少了工作量及工作经费。在日常生活饮用水监测中，第一法相对第二法过滤法更简便易行；相对第三法酶底法来讲，更经济实惠。因此，第一法多管发酵法，在常规检测工作中仍是值得推广的方法。 3.5、不同稀释度的大肠埃希氏菌液在EC-MUG培养液中，产生荧光效果无显著区别。因此，总大肠菌发酵后，在下步实验操作中，移液管要一管一用，不同发酵管不能出现交叉污染，防止阳性值偏高。 参考文献 [ 1] GB5749-2006，生活饮用水标卫生标准 [S]。北京：中国标准出版社，2007 [2] , zzzzzz。水中,mmm mmm mmmJ]. 河南预防医学杂志2009年20(3):185-216. [8] GGkkk.生活饮[J].预防医学论坛, 2008，14(12)：1163-1164. [9]hhhhhhhhh等.南方地区农查[J]. 公共卫生与预防医学,2014，25(4):11-13. [gggg[J]。环境科技，2010，23（1）：67－70 [3]
粪大肠菌群Fecal Coliforms1 定义 本规范采用下列定义 粪大肠菌群（Fecal coliforms）系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.5℃±0.5℃培养24h～48h能发酵乳糖产酸并产气。 该菌直接来自粪便，是重要的卫生指示菌。3 仪器3.1 恒温水浴箱或隔水式恒温箱：44℃±0.5℃。3.2 温度计。3.3 显微镜。3.4 载玻片。3.5 接种环。3.6 电磁炉。3.7 三角瓶，250mL。3.8 试管：15×150mm。3.9 小倒管。3.10 pH计或pH试纸。3.11 高压灭菌器。3.12 灭菌吸管，10mL、1mL。3.13 灭菌平皿：直径90mm。4 培养基和试剂4.1 双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基 成分：蛋白胨 40g 猪胆盐 10g 乳糖 10g 0.4％溴甲酚紫水溶液 5mL 卵磷脂 2g 吐温80 14g 蒸馏水 1000mL 制法：将卵磷脂、吐温80溶解到少量蒸馏水中。将蛋白胨、胆盐及乳糖溶解到其余的蒸馏水中，加到一起混匀，调pH到7.4，加入0.4％溴甲酚紫水溶液，混匀，分装试管（每支试管中加一个小倒管）。68.95kPa（115℃ 10 lb）20min灭菌。4.2 伊红美兰（EMB）琼脂 成分：蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 2g 琼脂 20g 2％伊红水溶液 20mL 0.5％美蓝水溶液 13mL 蒸馏水 1000mL 制法：先将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾蛋白胨，混匀，使之溶解。再以蒸馏水补足至1000mL。校正pH值为7.2～7.4，分装于三角瓶内，103.43kPa（121℃ 15 lb）15min高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂。冷至60℃左右无菌操作加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀。倾注平皿备用。4.3 蛋白胨水（作靛基质试验用） 成分：蛋白胨（或胰蛋白胨） 20g 氯化钠 5g 蒸馏水 1000mL 制法：将上述成分加热融化，调pH值为7.0～7.2，分装小试管，103.43kPa（121℃ 15 lb）15min高压灭菌。4.4 靛基质试剂 柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL。 试验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于44℃±0.5℃培养24h±2h。沿管壁加柯凡克试剂0.3mL～0.5mL，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。 注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。4.5 革兰氏染色液：4.5.1 染液制备4.5.1.1 结晶紫染色液： 结晶紫 1g 95％乙醇 20mL 1％草酸铵水溶液 80mL将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。4.5.1.2 革兰氏碘液： 碘 1g 碘化钾 2g 蒸馏水加至 300mL 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。4.5.1.3 脱色液：95％乙醇。4.5.1.4 复染液： a 沙黄复染液： 沙黄 0.25g 95％乙醇 10mL 蒸馏水 90mL 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 b 稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95％乙醇100mL，放置过夜，滤纸过滤。取该液10mL，加5％石碳酸水溶液90mL混合，即为石碳酸复红液。再取此液10mL加水90mL，即为稀石碳酸复红液。4.5.2 染色法4.5.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。4.5.2.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。4.5.2.3 滴加95％乙醇脱色，约30s，或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s，水洗。4.5.2.4 滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。4.5.3 染色结果 革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。注：如用1:10稀释石碳酸复红染色液作复染，复染时间仅需10s。5 操作步骤5.1 取10mL 1:10稀释的检液，加到10mL双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基中，置44℃±0.5℃培养箱中培养24h～48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。5.2 如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃培养18h～24h。同时取该培养液1～2滴接种到蛋白胨水中，置44℃±0.5℃培养24h±2h。 经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应注意挑选。5.3 挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。5.4 在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。6 检验结果报告根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。
就我所掌握的浅薄的一点东西，跟楼主探讨一下：1.据我所知标准好像都是三个梯度，食品大肠菌群检测是采用九管法，而水质大肠菌群采用的15管法。2.对于第二个问题，我有点糊涂了，国标中规定不同的食品中大肠菌群限值不同，我没有见过0.01这么小的数，一般好像都是每100g/mL不得检出，或者少于30，40；另外您的0.01是从何而来，可以告诉我出处吗？
1.小玻璃管是杜氏小管，倒置在试管中。在倒培养基的时候，要先将杜氏小管装满，然后再一起倒扣在试管中。试管什么规格都可以。这样，培养菌的时候，如果杜氏小管中有气泡，也该菌是产气的。试管的支数是随你实验订的。一般一个水样浓度做3支。2.EC培养液最好按照试剂来配。3.我们在实验室用棉花塞加牛皮纸包起来，用橡胶塞应该也可以。
快速就是分子诊断试剂盒，LB培养基
修改:相关网站:我给你提供一些大肠杆菌的资料,比较乱,自己去整理.三凉食品这个术语没有听说过,如果可以解释一下,或许我会知道.大肠杆菌O157: H7实验诊断研究进展 大肠杆菌O157: H7感染临床表现出血性肠炎：鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不发热。 溶血性尿毒综合征（HUS）：主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1-2周。病死率一般在10%，各别可高达50%。血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：主要发生在成年人，尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病死率高，有时可出现70%的病人死亡。大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌，可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。在实验室，大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题我国情况也不容乐观一、细菌培养与鉴定 1．分离培养早期培养对确定病原有重要意义。 培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接触者。培养基：山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂改良的伊红美兰 、改良的SD-39（MSD）琼脂 添加了头孢克肟 和 亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）添加了头孢克肟和鼠李糖（0.5%)的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC）“科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基四溴荧光亚甲基兰琼脂H7抗血清—山梨醇发酵培养基 增菌液：含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤新生霉素MEC肉汤月桂基胰蛋白胨肉汤加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性头孢克肟 0.05mg/L 亚碲酸钾2.5mg/L 新生霉素10mg/L 万古霉素40mg/L2．免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。方法:1.增菌;2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免疫磁珠20ul;3.轻轻混合10分钟;4.将试管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重复3-5过程;7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C-头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。37℃培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。Chapman等 共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需 2cfu/g 。Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。 Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157: H7。在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157: H7爆发中,用IMS、粪便培养和多聚酶链反应(PCR)检测Vero毒素基因的携带,用三种方法对粪便大肠杆菌O157: H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接培养和IMS均阳性20 份,另13份仅IMS阳性。因此,IMS提高了大肠杆菌O157: H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。目前，污染的肉、家畜，甚至饮用水均面临大肠杆菌O157: H7的卫生威胁。检测食品和水源中肠道病原体使用传统的培养法,结果不理想。IMS和其它检测的研究表明,对快速检测食品和环境标本似乎前景良好,Yu检等以IMS结合电化学发光检测法(ECL)检测食品和污染物中的大肠杆菌。结果显示,在原缓冲液检出大肠肠菌的范固为100－1000 cfu/lm,在食品检出的范围为1000－2000cfu/lm ，检测时间十分快,一般不到1小时。菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。在监测牛群的4个月间,从牛采集1024份直肠标本,其中检出大肠杆菌O157: H784份（8.2%）84份中有23份（27.4%）由直接培养和IMS分离。23份中15份由两种培养基、5份仅由CT-SMAC、3份仅由CR－SMAC分离,其余61份(72.6%)仅IMS分离。用含吐温－20 的PBS洗涤磁珠可减少其它微生物与磁珠的非特异性结合。用无关的抗体包被磁,则大肠杆菌O157: H7不结合。IMS具有快速、操作简单、特异性高,在流行病学调查中有价值。 3．生化反应 目前许多国家使用的O157和 H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度交叉反应。因此用生化试验确定为大肠杆菌是必须的。典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：动力试验（+） 葡萄糖（+） 麦芽糖（+）甘露醇（+） 蔗糖（－/+） 硫化氢（－） 尿素（－） 靛基质（+） 甲基红（+） V-P试验（－）枸橼酸盐（－）苯丙氨酸脱羧酶（－）赖氨酸脱羧酶（+/－）鸟氨酸脱羧酶（ +/ －）氧化酶（－）氰化钾（－）与O157有鉴别意义的生化反应见表1。MUG即4-甲基伞形化内酯-β-葡萄糖醛酸苷。大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG产生荧光, 但O157: H7中大多数菌株则不水解MUG。Thompson等建立了一种快速MUG试验,取 MUG试剂0.5ml置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养物混匀于其中,44.5℃置20min,暗室内高强度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳性。 二．血清学检测1．玻片凝集试验2. 胶体金免疫技术3. ELISA 4．免疫荧光技术5．胶乳凝集 6. 间接血凝分析(IEHA)7. 全自动抗原抗体检测系统8. 免疫印记法1．玻片凝集试验玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法,实验中如果凝集反应不明确，但根据临床表现和生化反应等菌株高度可疑时,可100℃加热菌液30min再行玻片凝集试验。这样可去除K抗原的影响。为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性,应继而做试管凝集反应,所测得的效价不应低于诊断血清原标定效价的一半。鉴定H抗原也应同时做玻片和试管凝集试验,并应先对待检菌做动力试验,在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。2. 胶体金免疫技术胶体金免疫技术特点是以胶体金作为标记物进行的抗原抗体反应。这一技术最初用于免疫电镜技术。至今，在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的一种简便、快速的血清学检验方法。胶体金的制备多采用还原法，氯金酸是主要还原材料。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。胶体金免疫层析试验时以硝酸纤维膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一样。中国预防医学科学院微生物研究所利用胶体金技术、双抗体夹心法和显色反应等特点，研制了大肠杆菌O157: H7病原体快检金卡，通用于定性检测粪便、食品、水等样品中的O157: H7大肠杆菌。显色程度与样品中细菌含量成正比，最低测菌量为少于100个菌细胞，主要特点是敏感性高，可用于待检样品初筛，阳性样品可进行细菌分离，减少工作量。3. ELISA 大肠杆菌O157: H7的常用检测方法是粪便培养后作细菌分离,然后用生物化学和免疫学方法鉴定,一般需72 小时。Dylla等用一种快速ELISA直接检测粪便中大肠杆菌O157: H7,并与标准培养方法加以对照。结果显示,ELISA检测183份粪便标本,检出大肠杆菌O157: H7 9份。常规培养法阴性176份,而ELISA阴性174份。总特异性为98.9%。该法与其它非O157: H7大肠杆菌无交叉反应,是一种准确、敏感、特异、易观察结果的筛选方法，尤其适用于中、小实验室及大量粪便标本的流行病学调查。Padhye等用单克隆抗体进行直接ELISA反应检测O157: H7,除O26 ：H11外，未发现与沙门氏菌、结肠炎耶氏森菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反应。单克隆抗体用于检测大肠杆菌O157: H7有明显特异性，可作为一种免疫试剂用于临床和食物标本的快速检测。Clark 等近一步对单克隆抗体的研究发现,此种单克隆抗体识别的物质是LPS,这种LPS抗原决定簇用全细胞ELISA同样可以在其它血清型大肠杆菌和产生或不产生Vero毒素的大肠杆菌中检测到, 而且易受到胆盐、吖啶黄和温度的影响,但可以通过结合免疫捕获的修饰方案来提高ELISA的特异性。4．免疫荧光技术 DEFT 与Ab-DEFT： 直接荧光技术（DEFT）与抗体定位荧光技术(Ab－DEFT)的主要特点是,显微镜下直接计数样品菌细胞。由于无需培养或分离过程,因此检测非常快速。DEFT的基本原理为:对样品进行过滤,用荧光染料(如吖啶橙)对留在滤膜上的菌细胞染色后,用荧光显微镜观察计数。但由于荧光染料的非特异染色,不但被检菌被染色,本底杂菌也可染色,从而影响了结果的精确性。Ab-DEFT则克服了这一缺点,过滤后的菌细胞与荧光标记的特异抗体作用,然后用荧光显微镜观察计数。 固相荧光毛细管免疫分析此方法高度敏感，具有快速、试剂用量少、易于操作等优点。Czajlu等用热杀死的O157: H7菌包被玻璃毛细管作固形支持物。 样品中加入结合了生物素的O157: H7多克隆抗体,作用一段时间,然后将此样品/抗体混合物与标记了Cy5 (一种荧光花青染料)的亲和素加入到毛细管,孵育2min,冲洗、吹干,由激光传感器系统发射650nm波长激发光激发花青染料,之后用光学传感器系统测定荧光发射密度。直接免疫荧光抗体染色 Park等对粪便样品进行离心后,用免疫荧光抗体对粪便涂片进行标记,可检测到所有培养法证实的菌株,检测时间<2h。5．胶乳凝集 该方法是以胶乳颗粒作载体,以O157: H7特异性抗体致敏,制成特异的胶乳试剂,将标本乳化于玻片或有色烧盘上，滴加胶乳试剂,呈明显凝集而对照胶乳不凝集时即为阳性。 6．间接血凝分析(IEHA)该法多用于对LPS、可溶性本体抗原、未加热抗原的抗体检测,对检测H抗原的抗体效果不佳。Morooka等检测了溶血性尿毒综合征(HUS)病人血清LPS抗体,虽然甲醛化羊红细胞(SRBC)有低水平非特异性吸附,但不影响该方法作为一种有效、快速（<3h）的诊断方法。因为感染病人血清的滴度明显高于非特异性吸附。7. 全自动抗原抗体检测系统VIDAS是一种全自动抗原抗体检测系统。可直接从感染性疾病患者标本中检测细菌、病毒、弓形虫、衣原体和螺旋体等微生物的抗原、抗体或毒素。基本原理：采用酶联免疫（夹心法）原理，并在底物中掺入荧光物质，最终产生荧光产物4-甲基-7-羟刀豆素，荧光强弱与标本中被测物浓度相关，经扫描样本读数与标准比较计算出标准值，并根据阴性和阳性临界值判定结果。 8.免疫印记法目的是检测大肠杆菌O157: H7感染者血清中的O157脂多糖和溶血素特异性 抗体。基本原理是将提纯的脂多糖或溶血素用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过转移电泳转移到硝酸纤维膜上，然后用抗原抗体进行免疫检测。包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移电泳、免疫检测三部分。特点是具有比较高的特异性和敏感性 。免疫检测 将封闭好的硝酸纤维素膜按梳子齿的宽度剪成每一个泳道一条，依次编号。1) 每条加入1毫升用PBS稀释的病人血清，室温震荡2小时，同时设阳性对照和阴性对照；2) 用2.5毫升／条PBST震荡洗涤3次，每次5分钟；3) 加入用1毫升用PBS稀释的II抗，室温震荡1小时；4) 用2.5毫升／条PBST震荡洗涤2次，每次5分钟，再用PBS洗涤一次； 5) 将膜放入12毫升显色液中显色，室温震荡15-30分钟，至阳性对照出现满意的蓝紫色 ；6) 将膜放入蒸馏水中终止显色反应，照相；7) 当显色的条带和溶血素的分子量或0157脂多糖的条谱一致时，结果判断为阳性。二．分子生物学检测 分子生物学的出现，为更快诊断微生物提供了许多分子学工具。 这一新的研究是用基因型而不是表型因子来鉴定特异性病原体。因此其特异性更好。加之 操作程序自动化使得DNA分析在实验室应用中已成为常规操作。自动化DNA提取仪，聚合酶链式反应仪(PCR仪)，DNA序列分析仪，脉冲凝胶电泳仪(用于分离DNA大片段，如完整的染色体) 在疾病诊断中都是很有用的。 1．DNA探针探针(probe)标记：放射性核素 、非放射性物质标记 。探针的来源 ：①克隆的基因组DNA探针；②cDNA探针；⑧RNA探针；④寡核苷酸探针。标本处理：根据标本来源和量的不同而处理不同 。杂交方法：斑点杂交 、southern印迹 、原位杂交 、Northern印迹 等。杂交信号检测 ： (1)测量放射性核素射线脉冲数 (2)放射自显影 (3)显色法 (4)发光法。 O157: H7特异噬菌体上的sltⅠ、Ⅱ基因、大质粒溶血素基因及染色体上eae基因等都已制成了可杂交检测的特异探针。Beutin等曾用VT1(750bp,)、VT2(850bp)、溶血素(3.4kb)等探针进行流行病学调查。Thomas等用地高辛标记的VT2B亚单位基因、VT2C基因探针检测不同噬菌体型O157: H7菌。Huck等筛选了O157: H7大质粒上限制性片段,发展了一种2.0kb的Sma I片段探针,认为此探针对O157: H7血清型最为特异,可与所有O157: H7试验菌杂交。2. PCR技术 聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。PCR技术扩增体系的基本成分引物: PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40- 60%,浓度0.1-1umol/L 。TaqDNA聚合酶：浓度为1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增 。模板DNA：应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。 4×dNTPs ： dNTP储存液pH应为7.0，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200 umol/L为宜。缓冲液及其他成份：PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度0.2-2.5 mmol/L。 PCR技术循环参数PCR扩增是由变性、退火和延伸三个步骤反复循环而实现的。确定正确的循环参数是PCR成功的保证。循环参数1．变性温度和时间 模板DNA和PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败最常见的一个原因,在变性步骤，使温度达到双链DNA完全分离的变性条件是95 ℃ ，30s。对GC含量高的靶DNA序列，宜用较高的变性温度。在解链温度下，DNA的变性仅需几秒。但是，使反应管内达到解链温度需要一定的时间。原则上变性步骤应高温、短时，即要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。循环参数2．引物退火 引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应体系中的浓度 。对GC含量约50％，长20个碱基的典型寡核苷酸引物而言，最佳的退火温度为55 ℃ 。在温度较高的条件下退火，可提高PCR的特异性。 循环参数3．引物延伸 ：引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物的3’一OH末端，引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。如用TaqDNA聚合酶，一般取70-75 ℃ ，常用72 ℃ 。 延伸步骤的时间则取决于目标序列的长度、浓度和延伸温度。目标序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；反之，目标序列越短、浓度越高、延伸温度越高，所需的延伸时间则越短 一般而言，每1000个碱基的序列，延伸时间1分钟便足够了。对于扩增100—300个碱基的短序列片段，可省去延伸温度这一步骤，而采用快速简便的变性、退火双温循环。这是因为TaqDNA聚合酶即使在退火温度下仍保持很强的活性，而延伸过程可在退火温度转变为变性温度的过程中完成。 循环参数扩增产物长度 100bp 500bp 1000bp 2000bp94℃变性时间（秒） 30 30 60 6055℃复性时间（秒） 30 30 60 6072℃延伸时间（秒） 30 38 120 180一般作25-30个循环即可，进行最后一次循环时间、延伸时间增加5分钟。PCR扩增产物的检测方法PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。PCR技术类型 免疫PCR技术 原位PCR技术 不对称PCR技术 巢式PCR技术 反向PCR技术 逆转录PCR技术 复合PCR技术 彩色PCR技术 抗原捕获PCR技术增敏PCR技术 酶标PCR技术 二温式PCR技术 锚定PCR技术 定量PCR技术 毛细管PCR技术 多重PCR技术 巢式或套式PCR技术PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用(1)简单PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。其退火温度为60℃－63℃, 应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157: H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。引物：正链5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3',反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’ 其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld 。徐建国等根据O157: H7 特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（2）多重PCR:由于鉴定O157: H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157: H7的诊断价值方面进行了研究。Meng等同时扩增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。此引物设计可有效区别O157: H7血清型与O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为1087、227、224、166bp。严笠选用针对大肠杆菌O157: H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157: H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果复合PCR方法较单一PCR方法具有较高的特异性，12株O157: H7取得了稳定、可靠的阳性结果。能迅速、有效地与其它致病性大肠杆菌及沙门氏菌、志贺菌相鉴别。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（3）原位PCR:kurokawa等不用培养过程,直接用原位PCR技术结合落射显微镜,在单细胞水平快速检测O157: H7 。4.23SrRNA在大肠杆菌O157: H7分型、检测中的应用传统的细菌分类方法主要依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等特征。随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，微生物检测进入了基因时代，以核糖体核糖核酸序列为基础的分类方法为微生物的鉴别提供了新的分子生物学方法。如16srRNA、 23srRNA、 16-23srRNA区间序列分析等等，它完全不同于传统方法，具有快速、简便、敏感和特异等优点。23SrRNA基因特征：原核生物的核糖体有三种大小（分别为23S、16S、 5S）的rRNA。目前已知23SrRNA基因全长序列的菌种数目已达250种。长度大约为3000pb。对许多细菌的23SrRNA基因序列分析发现，其序列的可变性比16SrRNA基因要明显，特别是亲源关系近的种系。利用这些可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分类鉴定。同时对已知23SrRNA基因序列分析也发现，在最初的520pb中有6个保守区域（5-10区域），并发现，这6个保守区域中6区段和10区段最保守，该序列在14个菌种中完全一致。应用：检测临床感染性疾病的病原菌 首先，将两条引物设计在保守区，成为通用引物，而在变异区中选择序列作为特异性探针，先用通用引物作PCR扩增，可筛选出含有病原菌的样本，再用特异性探针与扩增产物进行杂交，对目的细菌作出鉴定，达到诊断病原体及分型的目的。鉴定特定细菌种属 目前认为，已发现的23SrRNA基因的IVSs具有种属特异性，可利用IVSs（插入序列）进行PCR扩增达到对某一种属细菌的诊断。在流行病学方面的应用利用可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分析。为流行病提供依据。除以上介绍的各方法外,常用的有效检测方法还有脉冲场电泳、随机扩增多态性DNA指纹分析、细胞毒试验等,在此不一一赘述。 大肠杆菌O157: H7的检验程序 样品 增菌6小时 磁珠浓缩 可疑菌落 山梨醇麦康凯琼脂G染色 生化反应 血清学 毒力基因 大肠杆菌O157: H7实验室诊断依据 有下列情况之一具有实验室确诊意义： 1) 从腹泻病患者的粪便标本中分离出大肠杆菌O157: H7 ；2) 经PCR或DNA杂交试验证实具有溶血素基因 及志贺样毒素基因；3) 腹泻病患者恢复期血清抗O157LPS IgG抗体呈4倍升高；4) 具有血性便的腹泻患者的急性期血清或恢复期血清，蛋白印记试验证实含有和O157LPS、EHEC溶血素或志贺毒素的特异性抗体．小结自从O157: H7被认识以来,对其基因的研究越来越细,已经探明了许多结构与功能基因,对其病因学、病理学及临床治疗方面均有很大促进作用。由于引起感染所需的O157: H7剂量很低,有必要发展一些灵敏度高的方法,用于快速有效地检测。另外,现已发现存在许多变异株,单用一种方法来检测往往是不够的。如发酵山梨醇的变异株用SMAC即不能检测到;由于许多非EHEC(EPEC、霍乱弧菌、志贺菌等)也可产生SLT,故单纯检测SLT也会产生假阳性结果。因此对一个样品的检测需结合使用多种方法才能获得准确的结果。 第三章 大肠菌群测定 一、大肠菌群检验(一)检验方法(二)培养基 (三)检验时应注意事二、大肠菌群的卫生学意义 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。 在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。一、大肠茵群检验(一)检验方法 1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时
用大肠杆菌显色培养基，检测原理：蛋白胨和酵母膏粉提供碳氮源和微量元素;氯化钠可维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂;十二烷基硫酸钠抑制革兰氏阳性菌;混合显色底物分别与大肠菌群和大肠杆菌所对应的酶发生特异性反应，水解底物，释放出显色基团，在淡黄色平板上大肠菌群产生橙红色的菌落，大肠杆菌产生蓝绿色的菌落。资料出自环凯官网。
《肠道菌群，为何震撼人心？有何巨大机会？》文章发出后，有朋友说，热心肠先生口气不小啊：一说要参与全球和国家公共营养和健康政策；一说要约见面，至少得投资XXXX才可以！
话说，我说的是肠道菌群的研究能给全球和国家公共营养和健康政策带来启示，不是说我能搞定；而另一个问题呢，这两天我的微信、电话爆掉了，只能躲闪着，好有时间把这篇文章写出来。
所以若不是要紧事、若不是带着诚意约我谈合作，再熟悉的朋友，最近请尽量不约我见面，尽量仔细阅读我这两篇文章，尽量多给我留一些时间写科普，可以不？
当然，可能有人会问，口气这么大的热心肠先生和他想的商业，靠谱么？
呃(⊙o⊙)…我只能说了，文如我人，我写的就是我想做的。
至于靠不靠谱，你自己确定就是喽，反正我在BP里确实是这么写的：
废话不多说了，今天我把其他可公开的内容分享出来：
①上道的热心肠先生和小伙伴们
有人说很喜欢上面这张图。
我也很喜欢，不过我更喜欢图上的标题。这不是因为我自恋于自己取的标题，而是因为这是我下半辈子会全力以赴的事业。
这个事业，是一门生意，但也可能会让我对这个社会、对客户的健康做出自己的贡献（别说我道德婊哈，我真是这么想的）。
当然，说实话，一开始我确实也在想要不要用这么大的标题，毕竟我和小伙伴们现在运营的公司，刚刚起步，小得不能再小：全职5人，兼职若干，所以快要累死宝宝们了。
那既然是起步阶段，说这么宏大一件事，不就是连走都还没学会，就想跑嘛？感觉热心肠先生有点忽悠啊？
so what？
在肠道这一超级赛道上驰骋，是我们的理想，我们至少已经上道了！
②对微生物和人类关系的新认识揭开疾病的秘密，带来新的历史机遇
N Engl J Med. 2002 Sep 19;347(12):911-20.
嘚瑟的话说完，我们回到正题。
我先分享两张看起来跟肠道关系不大，但实则可能关系极其密切的图。
十四年前，《新英格兰医学杂志》上发表了上面这张图，说明人类在50年里，通过努力，让一些跟特定微生物有关的疾病发生率大幅降低。
但同时对比的是，一些自身免疫性疾病发生率大幅攀升：
N Engl J Med. 2002 Sep 19;347(12):911-20.
当时人们很难解释这是为什么，那时候连人类基因组计划都还没有全部完成。
而第一个微生物组计划，6年之后才开始；美国圣路易斯华盛顿大学的Jeffrey Gordon教授和学生Peter Turnbaugh，也只是在2年之后才发表了第一篇肥胖和肠道菌群貌似有关系的论文。
但是现在人们逐渐意识到，这一切的发生，可能是因为我们与细菌等微生物，特别是肠道微生物的关系发生了根本性变化。
我们“消灭”了一些微生物，却没有“安排”其他有益微生物，去有效地训练免疫系统。而免疫系统功能发生障碍，可能促进了自身免疫性疾病逐步攀升。
理解了我们的健康和疾病、幸福和悲伤的转变，可能是因为自身与微生物的关系发生了根本性变化，我们就有可能有针对性地制定新的健康政策、开创新的商业领域、提升人类的健康和幸福感。
③喧嚣之中,哪些产品和服务会爆发
在上一篇文章里，我用过“喧嚣”这个词，确实很多企业正在利用“火热的”“逆天的”肠道菌群研究在给自己的产品和服务背书。
我觉得也无可厚非，乳酸菌饮料、酸奶、益生菌、益生元等，是大家自然而然能想到的，可用于改善肠道菌群的产品形态。
但远不仅于此，就如下面这些市场中已经成熟或者正在成熟路上，更性感的产品或服务：
当然，我个人认为，其中最性感的可能不是某个产品，而是这样一个全新的医疗健康上下游协作的模式：
从微生物检测出发，到提出个体化的治疗或营养方案，再到干预方案的执行，最后通过生理指标监控掌握干预的效果，可以形成一个完整的个体化医疗和健康管理闭环。
基于科学，围绕着这个闭环开展的商业模式、产品和服务设计，或许能在医疗健康领域大放异彩。
④新模式、新赛道里的7大历史机遇
这是今天这篇文章的主题内容，从上面说的闭环出发，我个人简单勾画了围绕着肠道健康可能形成的生态链。
基础研究、临床应用、疾病预防、产品研发、原料生产、媒体传播、母婴等七大领域都有很多机会。
行业很新，还有很多机会我可能并没有列出；而且因为新的研究发现不断涌现，每个列出的机会随时都面临着洗牌。
当然，我说的是商业机遇，至于科学研究的机遇，那会更波澜壮阔，这个不多表了。
⑤在美国有什么性感的公司？
师夷长技以制夷，这话说了一百多年了。可惜的是，在肠道领域，我们继续需要“师夷”。
美国人在微生物组研究上，超过中国很多，他们搞出来的公司，也是比中国公司性感很多。
上面列出来的公司，大家感兴趣的，可以去调研了解一下，感觉光是网站就比好些中国公司做得好。
⑥充斥伪科学甚至反科学的中国市场或许有讲科学的机会？
宿便有10斤？！我滴妈啊，我的肠道细菌只有2斤多，应付不过来啊！
这时候，我们需要对肠道的科学认识：
Am J Gastroenterol Suppl 2012; 1:15– 21
在中国，有很多神奇的号称能包治百病的产品：
这时候，应该有人扛起科学营养和膳食结构的大旗，造福于国人：
在中国，包括一些“科学家”在内，在推广产品的时候也是懵懵懂懂（或许是自己心知肚明，想着让消费者懵懵懂懂着下单）：
这时候，需要正本清源：
需要特别说明一下，上面这张图也只是对肠道细菌进行了大致分类；益生菌是否益生，要在菌株水平进行研究和声称，不过这就不展开多说了。
充斥着伪科学甚至反科学产品的中国市场，或许能给讲真科学的产品很大机会。
靠谱的公司和产品要扛起科学的大旗，共同建立起行业的声誉，真正能够利用科学，为提升中国人的健康水平、赢得消费者的认可做出自己的贡献。
现在热心肠先生的影响力还非常有限，但不管是现在力所能及，还是哪天拥有更大话语权，看到伪科学、反科学、忽悠人的人、公司、产品、服务，我都会提醒大家的。
⑦热心肠先生和小伙伴们专注的和布局的到底都有什么？
关于肠道知识和商机，我们貌似懂得比较多，但热心肠先生和小伙伴们自己要做的事却相对简单：
热心肠道 = 垂直社群（专业群体+目标人群）+ 可信的互联网商城
第一步做社群，第二步做靠谱商城。
上面的图，则是实现路径上我们做的互联网或实物产品。每个产品都在摸索中，也都有一些进展，我们每天都在实实在在帮助用户，商业运作则在逐步展开。
同时，热心肠先生也在筹备一支肠道健康投资基金。我们自己不做也做不了，但是在肠道超级赛道上的优质公司，我们会通过投资适当参与。
当然，为避免广告，也因为跟某些投资人的约定，很抱歉就不敞开讲了。
食品快速检验检测技术以其简捷性和便携性两大优势得到了快速发展。 下面是我为大家整理的食品快速检测技术论文，希望你们喜欢。
食品的快速检验检测技术
摘要：食品安全已成为社会关注的焦点问题。文章介绍了目前常用的食品安全快检技术，并展望了其发展方向。
关键词：食品安全 快检 技术综述
引言
食品安全(food safety)是指食品无毒、无害，符合应当有的营养要求，对人体健康不造成任何急性、亚急性或者慢性危害。俗话说“民以食为天”，食品安全关系到人民群众的身体健康和生命安全，关系到社会和谐稳定，而近年来食品安全问题层出不穷，加了吊白块的面粉，有毒的大米，注了水的鸡肉，掺了石蜡的火锅底料，硫酸泡过的荔枝，以及假酒假烟假蜂蜜劣质奶粉充斥着市场，真让老百姓担心起这片“天”。因此，对食品的生产、加工和销售环节实施监测监控势在必行，食品安全分析检测技术应运而生。
传统的食品安全分析检测技术主要是指化学分析法和大型仪器检测法，相对成熟。但它们的操作只能局限于实验室，操作复杂，耗时长，不能满足对食品质量安全实时监督掌控的需求，尤其在突发事件时，快速检验检测技术以其简捷性和便携性两大优势得到了快速发展。
1、食品快速检验检测技术的研究现状
1.1 化学速测技术
化学速测技术主要是根据待测成分的某些化学性质，将样品与特定试剂发生水解、氧化、磺酸化或络合等化学反应，通过与标准品的颜色比较或特定波长下的吸光度比较，以获得检测结果，通常也成为化学比色分析法。
利用普通化学原理的速测法主要包括检测试剂和试纸，随着检测仪器的不断发展，国内外均已有与测试剂相配套的微型光电比色计。针对试纸检测的仪器也有报道，如硝酸盐试纸条[1]，主要是将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在弱酸性条件下与对氨基苯磺酸重氮化后，和N-1-盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，试纸变色，插入检测仪读数即可。德国默克公司生产的与试纸联用的光反射仪技术相对成熟，国内尚无商品化仪器问世。
利用生物化学原理的速测法主要应用于微生物的检测，商品化成品以美国3M公司的PerrifilmTM Plate系列微生物测试片为代表，在检测金黄色葡萄球菌时，只需要测试片与确认片配套使用即可。测试片有上下两层薄膜组成，下层的聚乙烯薄膜上印有网格，便于计数，同时覆盖着含有特异性显色物质和抗生素的培养基，若样品中含有金黄色葡萄球菌，无须增菌，直接接种纸片培养24h后便可观察到显示出特殊颜色的菌落;确认片与测试片相似，只是含有不同的特异性显色物质，将有疑似菌落的测试片影印到确认片后，培养1-3h即可观察，不需进行繁琐的生理生化鉴定。而常规的Baird-Parker平板计数法耗时长达78h。
1.2 酶抑制速测技术
酶抑制速测技术主要用于食品中农药残留和重金属的快速检测。这些物质可通过键合作用造成酶的化学性质和结构的改变，产生的酶-底物结合体会发生颜色、吸光度或者pH值的变化，通过测定这些变化以达到定性或定量检测的目的。根据检测方式的不同，可分为试纸法、pH计法和光度法。相比而言，试纸法成本低、操作简单，更易于推广。它主要是将酶和底物分别固定在两张试纸片上，当样品中有待测组分时，会对酶产生抑制作用，两张试纸片接触后，酶和底物结合便会发生显著地颜色变化，比较适合农贸市场和超市等一些食品集散地的实时安全监管。由于该方法的检出限和保存性等方面的局限，只适用于初筛检测[2]。
1.3 生物传感器速测技术
生物传感器技术是利用生物感应元件的专一性，按照一定的规律将被测量转换成可用信号，使这种信号强度与待测物浓度形成一定的比例关系，具有快速、灵敏、高效的特点，是目前食品安全检测技术的研究热点，广泛应用于食品中农药残留、兽药残留等方面的检测，与传统的离线分析技术相比，它更适应于在复杂的体系内进行快速在线连续监测，在现场快速检测领域有着不可逾越的优势，按照传感器类型又可分为免疫传感器、酶传感器、细胞传感器、组织传感器、微生物传感器等等。
免疫传感器是在抗原抗体结合免疫反应的基础上发展起来的生物传感器。利用压电免疫传感器检测食品中常见肠道细菌时，通过葡萄球菌蛋白A将肠道菌共同抗原的单克隆抗体宝贝在10MHz的石英晶体表面，以大肠菌群为例，响应值可达10-6-10-9。
1.4 免疫速测技术
免疫速测是利用抗原抗体的专一、特异性反应建立起来的方法，根据选用的标记物可分为放射免疫检测、酶免疫检测、荧光免疫检测、发光免疫检测、胶体金免疫检测等。酶联免疫吸附检测法是应用较为广泛的一种免疫速测技术。它将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/抗原即酶结合物，抗原抗体反应信号放大后，作用于能呈现出颜色的底物上，可通过仪器或肉眼进行辨别。目前，黄曲霉毒素酶联免疫试剂盒已广泛应用于食品检测中。
1.5 分子生物学速测技术
聚合酶链式反应(PCR)是近年来分子生物学领域中迅速发展并运用的一种技术，在食品检测中主要用于微生物的检测。它利用是否能从待测样品所提取的DNA序列中扩增出与目标菌种同源性的核酸序列来判定是否为阳性，该方法从富集菌体、提取遗传物质、PCR扩增到电泳、测序鉴定，可控制在24h，而致病菌的传统培养检测至少需要4-5天。
随着研究的逐深入，由PCR技术派生出的实时荧光PCR法、DNA指纹图谱法、免疫捕获PCR法、基因芯片法等也逐步得到了应用。基因芯片技术可以在很小的面积内预置千万个核酸分子的微阵列，利用细菌的共有基因作为靶基因，选用通用引物进行扩增，利用特异性探针检测这些共有基因的独特性碱基，从而区分出不同的细菌微生物。该法特异性强、敏感性高，可实现微生物检测的高通量和并行性检测。
2、食品快速检验检测技术的发展方向
食品安全快检法以其简捷性和便携性两大优势得到了快速发展，但缺点也显而易见，需要完善的地方依然很多：
2.1 简单 速检验检测技术往往是由一些非专业技术人员使用，因此，检测方法采样、处理、检测、分析等各个环节简单、易行是该方法的一大发展趋势。
2.2 准确 检法前处理简单，势必导致待测样品纯度不高，基体干扰大。因此，在今后方法的研究中，应更多关注与如何避免假阳性结果，尤其是在分子生物学速测法中，增强靶基因的特异性、引物的特异性、排除死菌体造成的假阳性应得到进一步探索。
2.3 便携 着微电子技术、智能制造技术、芯片技术的发展，检测仪器应向微型化、集约化、便携化方向发展，以满足更多的现场、实时、动态的检测要求。
2.4 经济 测成本的高低直接决定着检测技术能否得到广泛的推广和应用，如何在确保又好又快的检测基础上，尽最大可能的降低成本也是今后的研究方向。
2.5 标准化前，我国尚未制定出与食品安全快速检测技术相关的标准和规范，这也阻碍了快检法的推广和应用。随着技术的提高和检测中对快检法的需要，应及时制定出相关标准规范以增强快检结果的认可性和权威性。
参考文献
[1]房彦军，周焕英，杨伟群。试纸-光电检测仪快速测定食品中亚硝酸盐的研究【J】解放军预防医学杂志，2004，22(17)：18-21
[2]易良键。食品安全快速检测方法的应用和研究【J】中国信息科技，2012，3：46
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果蝇肠道菌群检测方法主要有以下几种：1. 分离培养法：采用传统的分离培养技术，将果蝇肠道菌群进行分离、纯化和鉴定。这种方法可以获得单一菌株并进一步进行鉴定和功能研究，但存在着许多无法被培养的细菌不能被检测的缺点。2. 16S rRNA PCR扩增技术：采用PCR扩增果蝇肠道中16S rRNA基因片段，并通过高通量测序技术对扩增产物进行测序。这种方法可以获得细菌的群落信息，并能够检测无法被培养的细菌，但是序列读长有限，可能会受到污染物的影响。3. 全基因组测序：对于完整的菌株或样本中的所有微生物群落，使用全基因组测序技术，获得所有基因的信息。这种方法不仅可以获取16S rRNA序列以外，其他基因的信息，而且还能进行比较深入的分析。4. FISH法：FISH法是一种非常特别的细胞学方法，它可以直接用荧光标记的DNA探针针对目标菌株特异性地瞄准其16S rRNA，并识别出菌群在组织样品中真正存在的位置。不同的方法有不同的适应范围和优缺点，可以根据具体情况选择合适的方法进行果蝇肠道菌群检测。
根据可培养细菌的数量分类在肠道菌群中，可以培养到的细菌有400余种，依据其数量多少可以分为主要(优势)菌群(predominantmicroflora)和次要菌群(sub—dominantmicroflora)。
①主要(优势)菌群：指肠道菌群中数量大或种群密集度大的细菌，一般在10～10cfu/g以上，包括类杆菌属、优杆菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属和梭菌属等专性厌氧菌，通常属于原籍菌群。优势菌群是对宿主发挥生理功能的菌群，在很大程度上影响着整个菌群的功能，决定着菌群对宿主的生理病理意义。
②次要菌群：数量在10～10cfu/g以下，主要为需氧菌或兼性厌氧菌，如大肠杆菌和链球菌等，流动性大，有潜在致病性，大部分属于外籍菌群或过路菌群。
检测方法：
1、采样及稀释
（1）按无菌操作法将检样25g（或25mL）放于含有225mL无菌水的三角瓶中（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以8000～10000r/min的速度离心1min，做成1：10的稀释液。
（2）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1Ml，注入含有9mL无菌水的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释液，换用1支lmL灭菌吸管，按上述操作依次作l0倍系列稀释液。
（3）根据食品的卫生要求或对检验样品污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。
2、乳糖初发酵试验
即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双倍乳糖胆盐发酵管。
lmL及1mL以下者，用单倍乳糖胆盐发酵管。每一个稀释度接种3管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。
3、分离培养
将产气的发酵管分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板，置36±1℃温箱内培养18～24h，然后观察菌落形态并作革兰氏染色、镜检并作复发酵试验。
4、乳糖复发酵试验
即通常所说的证实试验，其目的在于证明经乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰阴性无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。
在上述选择性EMB培养基上，挑取可疑的大肠菌群菌落1～2个进行革兰染色，同时接种乳糖发酵管，置36±l℃温箱内培养24±2小时，观察产气情况。
凡乳搪发酵管产气，革兰染色为阴性反应的无芽胞杆菌，即报告为大肠菌群阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰染色为阳性，则报告为大肠菌群阴性。
扩展资料：
有益菌菌群的生理功能：
如果肠内有益菌菌群占优，肠内黏膜呈现粉红色，表示肠内环境相当良好。
1、吸收水分，粪便较软，较易排泄
在胃部分解消化的食物，经由小肠吸收营养后，成为粘稠状物体送至大肠。然后再经过18小时将水分及矿物质吸收，就变成容易排泄的粪便。肠道内环境良好时，粪便的软硬适中，排便会较为顺利。
2、缓和的蠕动，能顺利将粪便排出
藉由肠的蠕动，将粪便缓慢的推送至肛门。如果蠕动过快或太慢，都将影响粪便的构成，导致便秘或者腹泻。而如果肠内干净，则蠕动的速度就相当的有规律，粪便可顺利排出。
3、有助维他命的合成
比菲德氏菌等好菌能维护肌肤的健康，并具有合成有助热量产生的维他命B1、B2及B6等，以及与止血、骨骼形成有关的维他命K等之功用。健康的肠道，好菌会不断繁殖，维他命的合成也可顺利进行。
4、迅速排出有害物质
健康的肠道并非完全没有坏菌的存在，有害物质多少会产生。当然还包括，吃进体内的食品化学添加物或是无法成为营养成分的物质。只要肠内环境良好，这些物质在开始危害身体前就被排出体外。
5、避免病原菌的侵害
比菲德氏菌等好菌可以刺激并提高身体的免疫机能，而且易引起食物中毒等病原菌因具怕酸特质，所以像是含有好菌的乳酸饮料或健康食品等，都可抑制病原菌在肠内繁殖。
肠道有益菌菌群除了以上功能之外，对人体还有营养作用，如糖尿病、高血压、高血脂等。B族维生素和非必需氨基酸对人类的毛发具有重要的作用，当缺少这些营养元素，会导致头发脱落或毛发发黄、发叉，容易折断等现象。
参考资料来源：百度百科-肠道菌群
现在，生物技术的发展更是突飞猛进，这必将促成生物检测方法的不断补充和完善。 下面是我为大家整理的食品生物技术论文，希望你们喜欢。
食品检测中的生物技术分析
摘要：近年来，食品安全问题得到了全社会的关注，食品检测技术得到了更多的重视，生物技术等新兴的食品检测技术也因此而得到了广泛的应用。文章在简要介绍生物技术的基础上，详细阐述了生物技术在食品检测中的应用，以期为生物技术的发展与应用提供新的思路。
关键词：食品检测生物技术应用
食品安全问题是由于食品中含有毒、有害物质，对人体健康产生危害而造成的公共卫生问题。近年来，食品安全问题已成为人们普遍关注的社会热点问题，引起了政府和公众的广泛重视。目前，国内的食品安全问题的产生既有政府监管不严、制度体系不完全的原因，也有食品检测技术不够科学先进的原因。随着食品工业的快速发展，对食品检测技术提出了更高的要求，传统分析方法难以满足当前食品检测的需要，灵敏度高、特异性强、简便快捷的生物技术逐渐在食品检测领域大放异彩，文章将对此进行详细论述。
一、生物技术概述
生物技术是利用生物有机体及其组成部分，或是利用其组织、细胞、酶来合成、转化、降解，从而实现生产产品等目的的技术。生物技术在食品领域的应用已经有几百年的历史，从最初的面包、酱油生产，如今已延伸到食品领域的各个方面，得到了长足的发展和不断的完善。现代生物技术是建立在细胞生物学等学科基础之上的高科技技术，包括细胞工程、酶工程、基因工程、发酵工程等诸多类技术。细胞工程是以动物、植物细胞及细胞融合技术为基础的一类生物技术，主要用于食品生产;酶工程是通过特定细胞酶来控制食品生产过程中的物质转化;基因工程是通过重组基因来改造食品生物特性，起到生产特殊产品的作用;食品发酵技术如今已发展为发酵工程学，用于预定食品及成分的生产。
二、生物技术在食品检测中的应用
生物技术在食品检测中的应用，表现在食品中微生物、转基因成分等对人体有毒有害物质的检测。例如借助细菌学、血清学方法可以检测食品中是否含有致病菌，但是这些传统生物技术方法操作繁琐，耗时较长，目前应用更多的是操作简便、快捷且精准的生物芯片、胶体金免疫层技术、PCR技术、酶联免疫吸附法、基因探针等生物技术。
1.生物芯片的应用
生物芯片技术是建立在现代生物化学、物理化学、计算机科学等诸多学科交叉的基础上的，检测原理是利用生物分子间的抗原、抗体等亲和反应或碱基对互补杂交，检测、分析样品中的成分。由于生物芯片技术可在小面积内对多种生物分子进行并行检测分析，分析量很大，因而检测效率较高，检测结果具有很好的可比性。
生物芯片包括基因芯片和蛋白质芯片。基因芯片是将基因探针固化在检测工具表面，利用软件分析检测工具与样品间发生的基因杂交信息，从而检测出遗传信息。基因芯片可同时进行定性定量检测，能够快速检测分析大量序列的杂交信息。蛋白质芯片的原理则是利用生物分子间的特异性结合来测定样品成分，具体操作与基因芯片技术类似。基于基因芯片和蛋白质芯片的原理及特点，生物芯片技术通常用于转基因食品、原料、病原微生物的检测。
2.胶体金免疫层技术的应用
一直以来，胶体金免疫层技术在医学领域得到了广泛的应用，近年来逐渐应用于食品检测领域。胶体金免疫层技术具有操作简单、耗时较短等优势，一般需要定性分析或半定量分析，主要用于有害微生物、药物残留、违禁药物的检测。该技术用于有害微生物的检测较多，例如检测食品中是否含有大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌等致病菌，较为常见的检测方法是双抗体夹心法;用于药物残留的检测是通过制得的抗体抗原与药物残留反应来分析食品中是否含有黄曲霉毒素、磺胺类药物、氯霉素等残留;用于违禁药物的检测一般是利用竞争免疫层析法来分析食品中是否含有罂粟碱、吗啡等物质。目前国内应用胶体金免疫层技术仍处于初级阶段，尚未投入广泛的应用，还有待新型免疫层析产品的开发、研制。
3.PCR技术的应用
PCR技术是上世纪八十年代产生的一种技术，借助体外扩增DNA来实现转基因食品以及病原微生物的检测。传统PCR技术早于1992年便用于病原菌的检测，但直到近年来才得到广泛应用，目前可用于检测沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。但在实际应用中，传统技术存在一些缺陷，无法定量检测，而且存在死细菌的环境下检测结果不准确，难以检测微生物毒素，因此在传统技术的基础上经过一系列改进和技术融合产生了多种改进的PCR技术，包括实时定量的PCR技术、PCR―DGGE技术、巢式及半巢式PCR技术等。定时定量的PCR技术是在传统技术中加荧光基团来实现实时检测，能够做定量分析，主要应用于检测外源基因污染、病原微生物、掺假量等，例如检测葡萄中的曲霉菌、肉骨粉中的牛羊源成分。PCR―DGGE技术在传统PCR技术基础上结合变性梯度凝胶电泳技术，不仅特异性强，而且敏感度高。巢式及半巢式PCR技术通过设计两对或1对半引物来降低假阳性结果的产生，使检测下限大幅度下降，检测结果通常无需其他方法再验证。
4.酶联免疫吸附法的应用
酶联免疫吸附法是利用免疫或酶促反应来进行食品检测，具有操作简便、特异性强、耗时短、灵活、可批量检测的优势。酶联免疫吸附法用于有毒有害物质的检测比常规培养法耗时少三至四天，而且无需特殊设备支持，结果易于观察辨别，样品易于保存，例如有研究用该法检测牛奶中的沙门氏菌敏感性100%、特异性99.7%，检测时间不超过3天，因而广泛应用在黄曲霉毒素等毒素检测、残留药物检测、过敏原检测、生理活性物质检测、转基因食品检测等领域。
5.DNA探针技术的应用
DNA探针技术利用碱基对结合原理制成DNA探针，能够检测样品中的碱基序列，从而判定样品基因序列。由于该技术操作简便，而且检测结果精确度高，应用十分广泛，通常用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等检测。DNA探针技术主要有异相杂交和同相杂交两种技术，其关键在于针对检测目标构建相应的DNA探针，只有DNA探针的基因序列具有针对性和特异性，方能取得理想的检测结果。
三、结语
近年来，随着生物技术的发展和进步，其在食品安全领域发挥了越来越重要的作用，在食品检测的各个方面得到了广泛的应用。然而虽然生物技术普遍具有成本低、操作简便、效率高、特异性高等优势，但是在实际应用中各种生物检测技术均存在自身的局限性，需要结合实际需要灵活选择、搭配。为了更好的提高食品检测水平，解决食品安全问题，还需要开发新的生物检测技术和方法，对现有技术方法不断进行优化，这需要相关领域的专家学者持续不懈的努力
参考文献
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[8J水小溪，蔡乐，赵宝华.ELISA技术在食品安全检测中的应用[J].生命科学仪器，
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修改:相关网站:我给你提供一些大肠杆菌的资料,比较乱,自己去整理.三凉食品这个术语没有听说过,如果可以解释一下,或许我会知道.大肠杆菌O157: H7实验诊断研究进展 大肠杆菌O157: H7感染临床表现出血性肠炎：鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不发热。 溶血性尿毒综合征（HUS）：主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1-2周。病死率一般在10%，各别可高达50%。血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：主要发生在成年人，尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病死率高，有时可出现70%的病人死亡。大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌，可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。在实验室，大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题我国情况也不容乐观一、细菌培养与鉴定 1．分离培养早期培养对确定病原有重要意义。 培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接触者。培养基：山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂改良的伊红美兰 、改良的SD-39（MSD）琼脂 添加了头孢克肟 和 亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）添加了头孢克肟和鼠李糖（0.5%)的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC）“科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基四溴荧光亚甲基兰琼脂H7抗血清—山梨醇发酵培养基 增菌液：含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤新生霉素MEC肉汤月桂基胰蛋白胨肉汤加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性头孢克肟 0.05mg/L 亚碲酸钾2.5mg/L 新生霉素10mg/L 万古霉素40mg/L2．免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。方法:1.增菌;2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免疫磁珠20ul;3.轻轻混合10分钟;4.将试管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重复3-5过程;7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C-头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。37℃培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。Chapman等 共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需 2cfu/g 。Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。 Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157: H7。在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157: H7爆发中,用IMS、粪便培养和多聚酶链反应(PCR)检测Vero毒素基因的携带,用三种方法对粪便大肠杆菌O157: H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接培养和IMS均阳性20 份,另13份仅IMS阳性。因此,IMS提高了大肠杆菌O157: H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。目前，污染的肉、家畜，甚至饮用水均面临大肠杆菌O157: H7的卫生威胁。检测食品和水源中肠道病原体使用传统的培养法,结果不理想。IMS和其它检测的研究表明,对快速检测食品和环境标本似乎前景良好,Yu检等以IMS结合电化学发光检测法(ECL)检测食品和污染物中的大肠杆菌。结果显示,在原缓冲液检出大肠肠菌的范固为100－1000 cfu/lm,在食品检出的范围为1000－2000cfu/lm ，检测时间十分快,一般不到1小时。菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。在监测牛群的4个月间,从牛采集1024份直肠标本,其中检出大肠杆菌O157: H784份（8.2%）84份中有23份（27.4%）由直接培养和IMS分离。23份中15份由两种培养基、5份仅由CT-SMAC、3份仅由CR－SMAC分离,其余61份(72.6%)仅IMS分离。用含吐温－20 的PBS洗涤磁珠可减少其它微生物与磁珠的非特异性结合。用无关的抗体包被磁,则大肠杆菌O157: H7不结合。IMS具有快速、操作简单、特异性高,在流行病学调查中有价值。 3．生化反应 目前许多国家使用的O157和 H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度交叉反应。因此用生化试验确定为大肠杆菌是必须的。典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：动力试验（+） 葡萄糖（+） 麦芽糖（+）甘露醇（+） 蔗糖（－/+） 硫化氢（－） 尿素（－） 靛基质（+） 甲基红（+） V-P试验（－）枸橼酸盐（－）苯丙氨酸脱羧酶（－）赖氨酸脱羧酶（+/－）鸟氨酸脱羧酶（ +/ －）氧化酶（－）氰化钾（－）与O157有鉴别意义的生化反应见表1。MUG即4-甲基伞形化内酯-β-葡萄糖醛酸苷。大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG产生荧光, 但O157: H7中大多数菌株则不水解MUG。Thompson等建立了一种快速MUG试验,取 MUG试剂0.5ml置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养物混匀于其中,44.5℃置20min,暗室内高强度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳性。 二．血清学检测1．玻片凝集试验2. 胶体金免疫技术3. ELISA 4．免疫荧光技术5．胶乳凝集 6. 间接血凝分析(IEHA)7. 全自动抗原抗体检测系统8. 免疫印记法1．玻片凝集试验玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法,实验中如果凝集反应不明确，但根据临床表现和生化反应等菌株高度可疑时,可100℃加热菌液30min再行玻片凝集试验。这样可去除K抗原的影响。为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性,应继而做试管凝集反应,所测得的效价不应低于诊断血清原标定效价的一半。鉴定H抗原也应同时做玻片和试管凝集试验,并应先对待检菌做动力试验,在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。2. 胶体金免疫技术胶体金免疫技术特点是以胶体金作为标记物进行的抗原抗体反应。这一技术最初用于免疫电镜技术。至今，在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的一种简便、快速的血清学检验方法。胶体金的制备多采用还原法，氯金酸是主要还原材料。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。胶体金免疫层析试验时以硝酸纤维膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一样。中国预防医学科学院微生物研究所利用胶体金技术、双抗体夹心法和显色反应等特点，研制了大肠杆菌O157: H7病原体快检金卡，通用于定性检测粪便、食品、水等样品中的O157: H7大肠杆菌。显色程度与样品中细菌含量成正比，最低测菌量为少于100个菌细胞，主要特点是敏感性高，可用于待检样品初筛，阳性样品可进行细菌分离，减少工作量。3. ELISA 大肠杆菌O157: H7的常用检测方法是粪便培养后作细菌分离,然后用生物化学和免疫学方法鉴定,一般需72 小时。Dylla等用一种快速ELISA直接检测粪便中大肠杆菌O157: H7,并与标准培养方法加以对照。结果显示,ELISA检测183份粪便标本,检出大肠杆菌O157: H7 9份。常规培养法阴性176份,而ELISA阴性174份。总特异性为98.9%。该法与其它非O157: H7大肠杆菌无交叉反应,是一种准确、敏感、特异、易观察结果的筛选方法，尤其适用于中、小实验室及大量粪便标本的流行病学调查。Padhye等用单克隆抗体进行直接ELISA反应检测O157: H7,除O26 ：H11外，未发现与沙门氏菌、结肠炎耶氏森菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反应。单克隆抗体用于检测大肠杆菌O157: H7有明显特异性，可作为一种免疫试剂用于临床和食物标本的快速检测。Clark 等近一步对单克隆抗体的研究发现,此种单克隆抗体识别的物质是LPS,这种LPS抗原决定簇用全细胞ELISA同样可以在其它血清型大肠杆菌和产生或不产生Vero毒素的大肠杆菌中检测到, 而且易受到胆盐、吖啶黄和温度的影响,但可以通过结合免疫捕获的修饰方案来提高ELISA的特异性。4．免疫荧光技术 DEFT 与Ab-DEFT： 直接荧光技术（DEFT）与抗体定位荧光技术(Ab－DEFT)的主要特点是,显微镜下直接计数样品菌细胞。由于无需培养或分离过程,因此检测非常快速。DEFT的基本原理为:对样品进行过滤,用荧光染料(如吖啶橙)对留在滤膜上的菌细胞染色后,用荧光显微镜观察计数。但由于荧光染料的非特异染色,不但被检菌被染色,本底杂菌也可染色,从而影响了结果的精确性。Ab-DEFT则克服了这一缺点,过滤后的菌细胞与荧光标记的特异抗体作用,然后用荧光显微镜观察计数。 固相荧光毛细管免疫分析此方法高度敏感，具有快速、试剂用量少、易于操作等优点。Czajlu等用热杀死的O157: H7菌包被玻璃毛细管作固形支持物。 样品中加入结合了生物素的O157: H7多克隆抗体,作用一段时间,然后将此样品/抗体混合物与标记了Cy5 (一种荧光花青染料)的亲和素加入到毛细管,孵育2min,冲洗、吹干,由激光传感器系统发射650nm波长激发光激发花青染料,之后用光学传感器系统测定荧光发射密度。直接免疫荧光抗体染色 Park等对粪便样品进行离心后,用免疫荧光抗体对粪便涂片进行标记,可检测到所有培养法证实的菌株,检测时间<2h。5．胶乳凝集 该方法是以胶乳颗粒作载体,以O157: H7特异性抗体致敏,制成特异的胶乳试剂,将标本乳化于玻片或有色烧盘上，滴加胶乳试剂,呈明显凝集而对照胶乳不凝集时即为阳性。 6．间接血凝分析(IEHA)该法多用于对LPS、可溶性本体抗原、未加热抗原的抗体检测,对检测H抗原的抗体效果不佳。Morooka等检测了溶血性尿毒综合征(HUS)病人血清LPS抗体,虽然甲醛化羊红细胞(SRBC)有低水平非特异性吸附,但不影响该方法作为一种有效、快速（<3h）的诊断方法。因为感染病人血清的滴度明显高于非特异性吸附。7. 全自动抗原抗体检测系统VIDAS是一种全自动抗原抗体检测系统。可直接从感染性疾病患者标本中检测细菌、病毒、弓形虫、衣原体和螺旋体等微生物的抗原、抗体或毒素。基本原理：采用酶联免疫（夹心法）原理，并在底物中掺入荧光物质，最终产生荧光产物4-甲基-7-羟刀豆素，荧光强弱与标本中被测物浓度相关，经扫描样本读数与标准比较计算出标准值，并根据阴性和阳性临界值判定结果。 8.免疫印记法目的是检测大肠杆菌O157: H7感染者血清中的O157脂多糖和溶血素特异性 抗体。基本原理是将提纯的脂多糖或溶血素用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过转移电泳转移到硝酸纤维膜上，然后用抗原抗体进行免疫检测。包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移电泳、免疫检测三部分。特点是具有比较高的特异性和敏感性 。免疫检测 将封闭好的硝酸纤维素膜按梳子齿的宽度剪成每一个泳道一条，依次编号。1) 每条加入1毫升用PBS稀释的病人血清，室温震荡2小时，同时设阳性对照和阴性对照；2) 用2.5毫升／条PBST震荡洗涤3次，每次5分钟；3) 加入用1毫升用PBS稀释的II抗，室温震荡1小时；4) 用2.5毫升／条PBST震荡洗涤2次，每次5分钟，再用PBS洗涤一次； 5) 将膜放入12毫升显色液中显色，室温震荡15-30分钟，至阳性对照出现满意的蓝紫色 ；6) 将膜放入蒸馏水中终止显色反应，照相；7) 当显色的条带和溶血素的分子量或0157脂多糖的条谱一致时，结果判断为阳性。二．分子生物学检测 分子生物学的出现，为更快诊断微生物提供了许多分子学工具。 这一新的研究是用基因型而不是表型因子来鉴定特异性病原体。因此其特异性更好。加之 操作程序自动化使得DNA分析在实验室应用中已成为常规操作。自动化DNA提取仪，聚合酶链式反应仪(PCR仪)，DNA序列分析仪，脉冲凝胶电泳仪(用于分离DNA大片段，如完整的染色体) 在疾病诊断中都是很有用的。 1．DNA探针探针(probe)标记：放射性核素 、非放射性物质标记 。探针的来源 ：①克隆的基因组DNA探针；②cDNA探针；⑧RNA探针；④寡核苷酸探针。标本处理：根据标本来源和量的不同而处理不同 。杂交方法：斑点杂交 、southern印迹 、原位杂交 、Northern印迹 等。杂交信号检测 ： (1)测量放射性核素射线脉冲数 (2)放射自显影 (3)显色法 (4)发光法。 O157: H7特异噬菌体上的sltⅠ、Ⅱ基因、大质粒溶血素基因及染色体上eae基因等都已制成了可杂交检测的特异探针。Beutin等曾用VT1(750bp,)、VT2(850bp)、溶血素(3.4kb)等探针进行流行病学调查。Thomas等用地高辛标记的VT2B亚单位基因、VT2C基因探针检测不同噬菌体型O157: H7菌。Huck等筛选了O157: H7大质粒上限制性片段,发展了一种2.0kb的Sma I片段探针,认为此探针对O157: H7血清型最为特异,可与所有O157: H7试验菌杂交。2. PCR技术 聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。PCR技术扩增体系的基本成分引物: PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40- 60%,浓度0.1-1umol/L 。TaqDNA聚合酶：浓度为1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增 。模板DNA：应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。 4×dNTPs ： dNTP储存液pH应为7.0，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200 umol/L为宜。缓冲液及其他成份：PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度0.2-2.5 mmol/L。 PCR技术循环参数PCR扩增是由变性、退火和延伸三个步骤反复循环而实现的。确定正确的循环参数是PCR成功的保证。循环参数1．变性温度和时间 模板DNA和PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败最常见的一个原因,在变性步骤，使温度达到双链DNA完全分离的变性条件是95 ℃ ，30s。对GC含量高的靶DNA序列，宜用较高的变性温度。在解链温度下，DNA的变性仅需几秒。但是，使反应管内达到解链温度需要一定的时间。原则上变性步骤应高温、短时，即要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。循环参数2．引物退火 引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应体系中的浓度 。对GC含量约50％，长20个碱基的典型寡核苷酸引物而言，最佳的退火温度为55 ℃ 。在温度较高的条件下退火，可提高PCR的特异性。 循环参数3．引物延伸 ：引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物的3’一OH末端，引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。如用TaqDNA聚合酶，一般取70-75 ℃ ，常用72 ℃ 。 延伸步骤的时间则取决于目标序列的长度、浓度和延伸温度。目标序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；反之，目标序列越短、浓度越高、延伸温度越高，所需的延伸时间则越短 一般而言，每1000个碱基的序列，延伸时间1分钟便足够了。对于扩增100—300个碱基的短序列片段，可省去延伸温度这一步骤，而采用快速简便的变性、退火双温循环。这是因为TaqDNA聚合酶即使在退火温度下仍保持很强的活性，而延伸过程可在退火温度转变为变性温度的过程中完成。 循环参数扩增产物长度 100bp 500bp 1000bp 2000bp94℃变性时间（秒） 30 30 60 6055℃复性时间（秒） 30 30 60 6072℃延伸时间（秒） 30 38 120 180一般作25-30个循环即可，进行最后一次循环时间、延伸时间增加5分钟。PCR扩增产物的检测方法PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。PCR技术类型 免疫PCR技术 原位PCR技术 不对称PCR技术 巢式PCR技术 反向PCR技术 逆转录PCR技术 复合PCR技术 彩色PCR技术 抗原捕获PCR技术增敏PCR技术 酶标PCR技术 二温式PCR技术 锚定PCR技术 定量PCR技术 毛细管PCR技术 多重PCR技术 巢式或套式PCR技术PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用(1)简单PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。其退火温度为60℃－63℃, 应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157: H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。引物：正链5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3',反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’ 其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld 。徐建国等根据O157: H7 特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（2）多重PCR:由于鉴定O157: H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157: H7的诊断价值方面进行了研究。Meng等同时扩增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。此引物设计可有效区别O157: H7血清型与O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为1087、227、224、166bp。严笠选用针对大肠杆菌O157: H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157: H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果复合PCR方法较单一PCR方法具有较高的特异性，12株O157: H7取得了稳定、可靠的阳性结果。能迅速、有效地与其它致病性大肠杆菌及沙门氏菌、志贺菌相鉴别。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（3）原位PCR:kurokawa等不用培养过程,直接用原位PCR技术结合落射显微镜,在单细胞水平快速检测O157: H7 。4.23SrRNA在大肠杆菌O157: H7分型、检测中的应用传统的细菌分类方法主要依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等特征。随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，微生物检测进入了基因时代，以核糖体核糖核酸序列为基础的分类方法为微生物的鉴别提供了新的分子生物学方法。如16srRNA、 23srRNA、 16-23srRNA区间序列分析等等，它完全不同于传统方法，具有快速、简便、敏感和特异等优点。23SrRNA基因特征：原核生物的核糖体有三种大小（分别为23S、16S、 5S）的rRNA。目前已知23SrRNA基因全长序列的菌种数目已达250种。长度大约为3000pb。对许多细菌的23SrRNA基因序列分析发现，其序列的可变性比16SrRNA基因要明显，特别是亲源关系近的种系。利用这些可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分类鉴定。同时对已知23SrRNA基因序列分析也发现，在最初的520pb中有6个保守区域（5-10区域），并发现，这6个保守区域中6区段和10区段最保守，该序列在14个菌种中完全一致。应用：检测临床感染性疾病的病原菌 首先，将两条引物设计在保守区，成为通用引物，而在变异区中选择序列作为特异性探针，先用通用引物作PCR扩增，可筛选出含有病原菌的样本，再用特异性探针与扩增产物进行杂交，对目的细菌作出鉴定，达到诊断病原体及分型的目的。鉴定特定细菌种属 目前认为，已发现的23SrRNA基因的IVSs具有种属特异性，可利用IVSs（插入序列）进行PCR扩增达到对某一种属细菌的诊断。在流行病学方面的应用利用可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分析。为流行病提供依据。除以上介绍的各方法外,常用的有效检测方法还有脉冲场电泳、随机扩增多态性DNA指纹分析、细胞毒试验等,在此不一一赘述。 大肠杆菌O157: H7的检验程序 样品 增菌6小时 磁珠浓缩 可疑菌落 山梨醇麦康凯琼脂G染色 生化反应 血清学 毒力基因 大肠杆菌O157: H7实验室诊断依据 有下列情况之一具有实验室确诊意义： 1) 从腹泻病患者的粪便标本中分离出大肠杆菌O157: H7 ；2) 经PCR或DNA杂交试验证实具有溶血素基因 及志贺样毒素基因；3) 腹泻病患者恢复期血清抗O157LPS IgG抗体呈4倍升高；4) 具有血性便的腹泻患者的急性期血清或恢复期血清，蛋白印记试验证实含有和O157LPS、EHEC溶血素或志贺毒素的特异性抗体．小结自从O157: H7被认识以来,对其基因的研究越来越细,已经探明了许多结构与功能基因,对其病因学、病理学及临床治疗方面均有很大促进作用。由于引起感染所需的O157: H7剂量很低,有必要发展一些灵敏度高的方法,用于快速有效地检测。另外,现已发现存在许多变异株,单用一种方法来检测往往是不够的。如发酵山梨醇的变异株用SMAC即不能检测到;由于许多非EHEC(EPEC、霍乱弧菌、志贺菌等)也可产生SLT,故单纯检测SLT也会产生假阳性结果。因此对一个样品的检测需结合使用多种方法才能获得准确的结果。 第三章 大肠菌群测定 一、大肠菌群检验(一)检验方法(二)培养基 (三)检验时应注意事二、大肠菌群的卫生学意义 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。 在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。一、大肠茵群检验(一)检验方法 1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时