粪大肠菌群检测方法对比的论文

水样中的细菌包括很多“属”和很多“种", 我国《生活饮用水卫生标准》2006版[ 1] 的卫生学评价标准是以菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群和大肠埃希氏菌4项作为微生物指标。        总大肠菌群可来自人类和温血动物的肠道及自然环境, 包含有埃希氏菌属、柠檬酸菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属等一大群在37℃经24小时培养能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。他们在伊红美蓝平板生长特征是：（1）深紫黑色、具有金属光泽；（2）紫黑色、不带或略带金属光泽；（3）淡紫红色菌落。         耐热大肠菌群，又称粪大肠菌群，主要包括埃希氏菌属和耐热克雷伯菌属[6],是利用提高温度的方法将大自然的大肠菌群和粪便中的大肠菌群区分开的，它是一群能在44.5 ℃下生长的大肠菌群，只有来源于动物和人类粪便的大肠菌群能生长，而来自大自然的大肠菌群不能耐热生长[8-9]。         大肠埃希氏菌(Escherichiacoli),以前常称大肠杆菌, 广泛存在于人类和温血动物的肠道中, 是人类和动物肠道中需氧性共生菌的优势菌群, 维持宿主健康部分生理功能必需的肠道菌.虽然大多数的大肠埃希氏菌为非致病菌, 但是当宿主免疫力降低或细菌侵入肠道的外组织或器官时, 可引起肠外感染。某些血清型可产生毒素, 为致病性大肠埃希氏菌, 可引起人类腹泻。所以生活饮用水中大肠埃希氏菌成为肠道疾病的重要致病菌之一。[2] 他们从属范围逻辑关系如下      《生活饮用水卫生标准》2006版标准, 增加了生活饮用水中大肠埃希氏菌的检验。         为了提高实验室检测能力，近日，本实验室开展了生活饮用水中大肠埃希氏菌检测的质控活动，质控活动达到如下目标： 一、使用工作中分离的耐热大肠菌群、标准菌株产气肠杆菌、标准菌株大肠埃希氏菌三种菌进行试验，观察不同大肠菌群在EC-MUG培养基荧光实况，取得阳性标本荧光视觉效果。 二、使用的试管进行酸浸泡、蒸馏水处理和水龙水直接清洗处理，寻找大肠埃希菌荧光效果影响因素。 三、使用北京陆桥EC-MUG培养基试剂及青岛海博EC-MUG培养基试剂进行比较试验，评价实验室常规使用的试剂是否优良。 1材料与仪器 1.1 EC-MUG培养基, 购自北京陆桥有限责任公司、青岛海博 1.2伊红美兰培养基, 购自北京陆桥有限责任公司。 1.3营养肉汤，购自北京陆桥有限责任公司。 1.4培养箱, 36℃ ±1℃;44.5±0.5℃;波长366nm紫外灯 2方法与结果 2.1方法原理         大肠埃希氏菌能特异性产生产生β -葡萄糖醛酸酶(β -glucuronidase), 此酶能分解培养基上的EC-MUG荧光底物释放出荧光产物, 使培养基在366 nm紫外光下产生特征性荧光, 以此技术来检测大肠埃希氏菌。 2.2操作步骤与结果         上图是产气肠杆菌与大肠埃希氏菌在EC-MUG培养基经44.5℃培养后，在日光灯背景下，产气肠杆菌液体清亮，说明产气肠杆菌在44.5℃中不能生长繁殖；大肠埃希氏菌液体混浊，说明大肠埃希氏菌在44.5℃中能生长繁殖。         对上述经培养过的EC-MUG培养基，在日光灯观察背景下，使用366nm紫外线灯进行观察。产气肠杆菌依然清亮，无蓝光；不同稀释度的大肠埃希氏菌菌液有明显的蓝光，蓝光间无明显差别。因此，在观察大肠埃希氏菌发酵效果时，可以在普通光线下，使用366nm紫外线灯进行观察，结果显著。         上图为在暗室下对前述经培养过的EC-MUG培养基观察实验效果。大肠埃希氏菌发酵后产生荧光，并且不同稀释度的菌液，目视无显著差别；与产气肠杆菌效果阴性效果有非常明显的差别。产气肠杆菌培养管有微弱荧光，可能存在EC-MUG培养基自身有荧光事实！         该图是灭菌蒸馏水与EC-MUG培养基效果比对。1、2试管是泡酸清洗的试管，5、6为未泡酸清洗的试管。         在暗室下观察，产气肠杆菌在EC-MUG培养管相对于蒸馏水，用手机拍照有明显荧光，实际观察中，这种荧光相对弱些，但依然是有荧光产生。所以，普通试管及蒸馏水可能产生的荧光可以忽略不计，但试剂本身产生有一定量的荧光是实验事实。         因此，为了减少个人观察经验不足，建议，在实验过程中，应该带标进行比对观察，这样头脑中才有荧光阴阳直观效果。         上图中的耐热大肠菌群，是日常工作中检出的工作株，实验室证实他们在伊红美兰平板上能产生铁锈色样金属光泽的大肠菌群，属于耐热大肠菌群。目前该菌在EC-MUG培养基经44.5℃培养后中也能混浊生长。         在日光灯背景下用三用紫外灯366nm紫外线波观察，各个试管有微许蓝光，实际目视观察没有很强。手机拍照显示都有微量荧光效果，产气肠杆菌颜色似乎还更深点。可以判断全部10管试验管均为大肠埃希氏菌阴性。         上图为暗室下对产气肠杆菌和工作株的耐热大肠菌群在EC-MUG荧光效果图。手机拍照显示有较强荧光，实际目视效果较弱，如没有阳性对照比较，易误以为大肠埃希氏菌阳性结果。但在暗室下观察，该耐热大肠菌群、产气肠杆菌没有差别，也可以判断为结果阴性。         通过产气肠杆菌与实验室耐热大肠菌群在EC-MUG高温培养后的荧光效果比较。产气肠杆菌在高温中不能生长，液体清亮，也不能分解荧光底物。本实验室工作株耐热大肠菌群能在高温中生长，所以液体混浊，但本次工作菌株不分解分解培养基上的MUG荧光底物释放出荧光产物，通过与产气肠杆菌（商品标准菌株）比较，判定为荧光阴性，因此可能本实验室该耐热大肠菌群工作株是耐热克雷伯菌属。（耐热大肠菌群，又称粪大肠菌群，它由埃希氏菌属和耐热克雷伯菌属组成。非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语。）       以下图片为两种不同试剂用相同处理的试管进行EC-MUG培养观察效果：         暗室下观察荧光效果图，北京陆桥产品阴阳对照明显。         日光灯下，用紫外线灯观察荧光效果图，北京陆桥产品阴阳对照明显。         暗室下观察荧光效果图，青岛海博产品阴阳对照明显。                日光灯下，用紫外线灯观察荧光效果图，青岛海博产品阴阳对照明显。     上图为正常光线下的实验培养结果照片。         通过北京陆桥、青岛海博两种试剂的比较，两种试剂在不同方式处置的试管内培养大肠埃希氏菌，稀释倍数不同，产生的荧光效果是一样的。 3.讨论 3.1、有关文献及实验结果中，试管本身会产生微量荧光[3]。本次实验使用的试管分两部分，一部分是用酸浸泡试管七天以上，然后进行蒸馏水清洗；另一部分是直接用水龙头水直接清洗，两类试管均165℃2小时以上高温灭菌。两类试管分别均分装有蒸馏水对照、产气肠杆菌（标准菌株）、耐热大肠菌群（工作菌株）、大肠埃希氏菌株（标准菌株）。同一菌株在不同方法处置的试管，实验效果无差别，说明一般试管可能产生的荧光对实验没有影响。 3.2、EC-MUG培养基试剂本身经培养后会溢出一定的荧光物质，如果没有阳性对照作比较，可能会误以为是真阳性，造成假阳性结果。因此，初级实验者或日常工作中，应带标准菌株同步实验并观察实验结果。 3.3、两家试剂厂家生产的EC-MUG培养基，阳性结果产生荧光效果均显著，实际操作中，日常生活饮用水中的大肠埃希氏菌试验结果与阴性对照相差无异时，可以按未检出大肠埃希氏菌结果进行报告。 3.4、GB/T5750.12－2006检测大肠埃希氏菌有多管发酵法、滤膜法，大肠埃希氏菌酶底法。推荐的第一法为多管发酵法，是在检测总大肠菌发酵乳糖蛋白胨基础上，有选择地进行EC-MUG培养，从批量工作中，减少了工作量及工作经费。在日常生活饮用水监测中，第一法相对第二法过滤法更简便易行；相对第三法酶底法来讲，更经济实惠。因此，第一法多管发酵法，在常规检测工作中仍是值得推广的方法。 3.5、不同稀释度的大肠埃希氏菌液在EC-MUG培养液中，产生荧光效果无显著区别。因此，总大肠菌发酵后，在下步实验操作中，移液管要一管一用，不同发酵管不能出现交叉污染，防止阳性值偏高。 参考文献 [ 1] GB5749-2006，生活饮用水标卫生标准 [S]。北京：中国标准出版社，2007 [2] , zzzzzz。水中,mmm mmm mmmJ]. 河南预防医学杂志2009年20(3):185-216. [8] GGkkk.生活饮[J].预防医学论坛, 2008，14(12)：1163-1164. [9]hhhhhhhhh等.南方地区农查[J]. 公共卫生与预防医学,2014，25(4):11-13. [gggg[J]。环境科技，2010，23（1）：67－70 [3]

粪大肠菌群Fecal Coliforms1 定义 本规范采用下列定义 粪大肠菌群（Fecal coliforms）系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.5℃±0.5℃培养24h～48h能发酵乳糖产酸并产气。 该菌直接来自粪便，是重要的卫生指示菌。3 仪器3.1 恒温水浴箱或隔水式恒温箱：44℃±0.5℃。3.2 温度计。3.3 显微镜。3.4 载玻片。3.5 接种环。3.6 电磁炉。3.7 三角瓶，250mL。3.8 试管：15×150mm。3.9 小倒管。3.10 pH计或pH试纸。3.11 高压灭菌器。3.12 灭菌吸管，10mL、1mL。3.13 灭菌平皿：直径90mm。4 培养基和试剂4.1 双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基 成分：蛋白胨 40g 猪胆盐 10g 乳糖 10g 0.4％溴甲酚紫水溶液 5mL 卵磷脂 2g 吐温80 14g 蒸馏水 1000mL 制法：将卵磷脂、吐温80溶解到少量蒸馏水中。将蛋白胨、胆盐及乳糖溶解到其余的蒸馏水中，加到一起混匀，调pH到7.4，加入0.4％溴甲酚紫水溶液，混匀，分装试管（每支试管中加一个小倒管）。68.95kPa（115℃ 10 lb）20min灭菌。4.2 伊红美兰（EMB）琼脂 成分：蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 2g 琼脂 20g 2％伊红水溶液 20mL 0.5％美蓝水溶液 13mL 蒸馏水 1000mL 制法：先将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾蛋白胨，混匀，使之溶解。再以蒸馏水补足至1000mL。校正pH值为7.2～7.4，分装于三角瓶内，103.43kPa（121℃ 15 lb）15min高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂。冷至60℃左右无菌操作加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀。倾注平皿备用。4.3 蛋白胨水（作靛基质试验用） 成分：蛋白胨（或胰蛋白胨） 20g 氯化钠 5g 蒸馏水 1000mL 制法：将上述成分加热融化，调pH值为7.0～7.2，分装小试管，103.43kPa（121℃ 15 lb）15min高压灭菌。4.4 靛基质试剂 柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL。 试验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于44℃±0.5℃培养24h±2h。沿管壁加柯凡克试剂0.3mL～0.5mL，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。 注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。4.5 革兰氏染色液：4.5.1 染液制备4.5.1.1 结晶紫染色液： 结晶紫 1g 95％乙醇 20mL 1％草酸铵水溶液 80mL将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。4.5.1.2 革兰氏碘液： 碘 1g 碘化钾 2g 蒸馏水加至 300mL 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。4.5.1.3 脱色液：95％乙醇。4.5.1.4 复染液： a 沙黄复染液： 沙黄 0.25g 95％乙醇 10mL 蒸馏水 90mL 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 b 稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95％乙醇100mL，放置过夜，滤纸过滤。取该液10mL，加5％石碳酸水溶液90mL混合，即为石碳酸复红液。再取此液10mL加水90mL，即为稀石碳酸复红液。4.5.2 染色法4.5.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。4.5.2.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。4.5.2.3 滴加95％乙醇脱色，约30s，或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s，水洗。4.5.2.4 滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。4.5.3 染色结果 革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。注：如用1:10稀释石碳酸复红染色液作复染，复染时间仅需10s。5 操作步骤5.1 取10mL 1:10稀释的检液，加到10mL双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基中，置44℃±0.5℃培养箱中培养24h～48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。5.2 如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃培养18h～24h。同时取该培养液1～2滴接种到蛋白胨水中，置44℃±0.5℃培养24h±2h。 经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应注意挑选。5.3 挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。5.4 在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。6 检验结果报告根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。

就我所掌握的浅薄的一点东西，跟楼主探讨一下：1.据我所知标准好像都是三个梯度，食品大肠菌群检测是采用九管法，而水质大肠菌群采用的15管法。2.对于第二个问题，我有点糊涂了，国标中规定不同的食品中大肠菌群限值不同，我没有见过0.01这么小的数，一般好像都是每100g/mL不得检出，或者少于30，40；另外您的0.01是从何而来，可以告诉我出处吗？

1.小玻璃管是杜氏小管，倒置在试管中。在倒培养基的时候，要先将杜氏小管装满，然后再一起倒扣在试管中。试管什么规格都可以。这样，培养菌的时候，如果杜氏小管中有气泡，也该菌是产气的。试管的支数是随你实验订的。一般一个水样浓度做3支。2.EC培养液最好按照试剂来配。3.我们在实验室用棉花塞加牛皮纸包起来，用橡胶塞应该也可以。