【摘要】 目的研究下调bcl2基因表达后对神经胶质瘤细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。方法利用小分子rna干扰（small interfering rna，sirna）技术人工合成bcl2靶向sirna，转染神经胶质瘤细胞系shg44和tj905细胞，特异性沉默神经胶质瘤细胞shg44和tj905细胞bcl2基因表达。通过蛋白质印迹（western blot）分析、噻唑蓝（mtt）实验、transwell实验和流式细胞仪（fcm）检测，观察bcl2 sirna对转染细胞bcl2基因抑制效果、增殖能力的变化、侵袭能力的改变和细胞凋亡的影响。结果bcl2 sirna可特异性下调神经胶质瘤细胞系shg44和tj905细胞bcl2基因表达。bcl2下调的神经胶质瘤细胞增殖能力在不同时间点都受到抑制，侵袭能力也明显下降，但实验中未见细胞明显凋亡。结论下调bcl2基因表达可有效抑制神经胶质瘤细胞生长，降低细胞增殖和侵袭能力。
【关键词】 sirna; bcl2;神经胶质瘤;凋亡;基因
effect of bcl2 downregulation on proliferation, apoptosis and invasion of glioma cell lines
wang tianlu, sun tao, tao yi
department of neurosurgery, jiangsu cancer hospital，nanjing 210009,chinaabstract：objective to study how bcl2 downregulation influence on proliferation, apoptosis, and invasion of glioma cell lines.methodsbcl2 sirna was chemically synthesized and transfected into glioma cell line shg44 and tj905. the silencing of bcl2 expression in two cell lines were checked by western blot.. the effect of bcl2 supression on proliferation, invasion, and apoptosis of two cells were evaluated via mtt, cell transwell assay and flow cytometric method.resultsbcl2 sirna were effectively inhibited the expression of bcl2 gene in shg44 and tj905 glioma cell lines. silencing bcl2 gene expression leads to the growth suppression of both shg44 and tj905 cells at different time point.similarly, two cells invasion abilities were significantly reduced. however, no apparent effect on apoptosis was observed.conclusionour results have indicated that bcl2 gene silencing effectively inhibited growth, proliferation and invasion of glioma cells.
key words：sirna; bcl2; glioma; apoptosis; gene
1材料与方法
1.1材料 人神经胶质瘤细胞系shg44和tj905细胞购于中科院上海细胞库。www.lw881.comlipofectamintm2000（invitrogen公司）；总蛋白提取试剂盒，bca法蛋白定量分析试剂盒，mtt试剂盒（南京凯基公司）；annexin v fitc/pi试剂盒（bender medsystems公司）；transwell小室（美国corning costar公司）；bcl2一抗（武汉博士德公司），抗鼠二抗（cell signal公司）和superecl发光液(北京普利莱公司)；bcl2 sirna 根据胡海燕等[2]筛选序列设计，委托上海吉玛公司合成。
1.2细胞培养及处理将shg44和tj905细胞接种于细胞培养皿，加入含10%胎牛血清dmem培养基，在5%co2、37℃条件下培养，待细胞生长至对数生长期时用于实验。实验中分为实验组（转染 bcl2 sirna）、对照组（转染negative control）和空白组（blank）。
1.3bcl2 sirna序列的设计和合成引用已筛选出有效切割bcl2 mrna序列设计,由上海吉玛公司合成。序列如下: bcl2 sirna：sense 5′ aac agc tta taa tgg atg tac 3′； antisense 5′ aag tac atc cat tat aag ctg 3′。
1.4转染处理对数生长期的神经胶质瘤细胞培养于24 孔培养板中,细胞铺满孔板70%~80%左右，应用lipofectamintm 2000转染试剂，按照2∶1混合，在无血清培养基中孵育15min后，加入到孔板中，5%co2、37℃培养6h后，换液，加入新鲜培养基，继续培养24h。
1.5mtt实验分析各处理组洗3次，消化后以每孔1×104个细胞接种于96孔培养板中，加入培养液100μl/孔，37℃、5% co2培养。检测前4h每孔加入5μl的mtt溶液培养，到达检测点时弃培养液，每孔加入150μl dmso溶解蓝紫色结晶，振动10min后，用酶标仪测定各孔的吸光度值，取5孔的平均值。细胞存活率(%)=处理组吸光度值/空白组吸光度值。
1.6流式细胞仪检测细胞凋亡各处理组转染sirna 24h后刮下细胞1900r/min离心5min，弃上清，pbs洗3次，重悬于加入5μl annexin v fitc和10μl pi的1×buffer 500μl流式管中，应用bd公司流式细胞仪检测分析细胞凋亡情况。
1.7transwell实验评价侵袭性各处理组细胞消化后重悬于0.1%小牛血清培养基中，按照每个小室2×105个细胞加入至8μm孔径transwell小室的上室（实验前已铺matrigel胶），下室加入20%小牛血清培养基，37℃、5％co2条件下培养24h。取出transwell小室pbs洗2遍，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，pbs洗3遍后用棉球轻轻擦去上室细胞，显微镜下（×200）观察。
1.8western blot分析bcl2表达提取各处理组总蛋白，bca法定量后，加入上样缓冲液，取等量蛋白上样，15%sdspage中电泳。125ma电流下4℃转膜90min，5%脱脂奶粉封闭1h，加bcl2一抗(1∶300)室温孵育1.5h后，漂洗3次，每次10min，室温孵育二抗 (1∶2000)1.5h后漂洗，在暗室用superecl发光液显影，凝胶成像仪成像。βactin检测作为内对照。
1.9统计学方法数据以均数±标准差(±s) 表示,采用统计包spss13.0进行分析,p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1lipofectamintm2000有效转染sirnalipofectamintm2000与fam标记的对照组按2∶1（w/w）混合15min后转染shg44和tj905细胞。转染后24h后，流式细胞仪检测转染效率，见图1。
2.2bcl2 sirna有效下调实验组细胞bcl2表达如图2显示，实验组bcl2条带明显减淡、变细，对照组和空白组条带宽而深，表明实验组加入bcl2 sirna后，可有效下调bcl2基因表达。
2.3bcl2 sirna有效抑制实验组细胞生长shg44和tj905细胞于转染后不同时间点,进行mtt法检测吸光度值代表细胞生长数目水平。研究结果显示实验组shg44和tj905细胞转染bcl2 sirna后，细胞增殖水平在24h后的不同时间点均显著低于对照组和空白组(p<0.05)，见表1、2。细胞存活率分析显示，shg44和tj905细胞转染bcl2 sirna后存活率明显下降，36h达到最低点，见图3。a:shg44细胞空白组；b:shg44细胞fam标记转染组；c:tj905细胞空白组；d:tj905细胞fam标记转染组
2.4bcl2 sirna降低实验组细胞侵袭能力各处理组在转染24h后进行transwell实验评价细胞侵袭能力。如图4a和4b，实验组细胞穿膜细胞数明显减少；实验组2转染2倍bcl2 sirna，其穿膜细胞数较实验组1更少（p<0.05）。实验表明bcl2 sirna可有效降低实验组细胞侵袭能力，并且这种效应可能与bcl2下调程度呈正比。
2.5bcl2 sirna不诱导实验组细胞凋亡转染24h后进行流式细胞仪检测各组细胞凋亡。各处理组细胞均无明显凋亡，见图5a、5b。实验组、对照组和空白组凋亡率差异无统计学意义（p>0.05），提示bcl2基因表达下调不能诱导细胞凋亡。
3讨论
bcl2基因最初发现常易位于b细胞滤泡性淋巴瘤重链基因座，通常呈过度表达状态[3]。研究表明在淋巴瘤中bcl2可抑制多种致凋亡因素和fas途径诱导的凋亡，发挥着抑制细胞凋亡和延长细胞寿命的功能。近年，fels等[4]报道bcl2这种抗凋亡基因在ⅲ、ⅳ级神经胶质瘤及其胶质瘤细胞系中也呈明显过度表达，并且这种过度表达状态与治疗的耐药性直接相关。研究表明在胶质瘤中bcl2的作用方式与其表达水平相关：shinoura等[5]构建bcl2过表达腺病毒转染胶质瘤细胞，结果显示胶质瘤细胞中相对低表达的bcl2发挥着抗凋亡作用，过度表达bcl2可直接诱导胶质瘤细胞的凋亡，后者可能是通过fas通路实现的。为了进一步深入探讨bcl2基因在神经胶质瘤中过低表达的作用，本实验构建下调bcl2基因的特异性sirna，来研究bcl2基因沉默后对神经胶质瘤的影响。 bcl2基因作为一种抗凋亡基因，沉默后可抑制肺癌等多种肿瘤细胞生长[6]，但目前对于神经胶质瘤中bcl2基因表达是否与胶质瘤细胞增殖相关仍存在争论，一些研究者如nakasu和krishna等[78]认为bcl2基因的表达与神经胶质瘤生长无关，而holle等[9]研究得出与之相反的结果。我们转染bcl2 sirna沉默bcl2基因表达后研究发现，实验组shg44和tj905细胞增殖数目明显减少，增殖能力明显受到抑制。研究结果与holle等[9]报道bcl2基因对胶质瘤细胞增殖能力的维持发挥重要作用的结论一致。我们进一步研究发现，bcl2基因沉默后，实验组shg44和tj905细胞未见明显凋亡发生。相关研究如在白血病中，he等[10]研究指出bcl2 sirna可诱导急性早幼粒细胞白血病细胞nb4细胞凋亡；在宫颈腺癌中，futami等[11]研究表明下调宫颈腺癌hela细胞bcl2后凋亡明显增加。在神经胶质瘤中，jiang等[12]报道白藜芦醇,3′,4′,5′三羟(基)芪通过下调bcl2表达诱导神经胶质瘤u251细胞凋亡；lytle等[13]报道维胺酯通过下调bcl2途径诱导神经胶质瘤u87、u251和u138细胞凋亡。根据我们的研究结果，认为在神经胶质瘤shg44和tj905细胞中仅单独沉默bcl2基因表达并不能直接诱导神经胶质瘤细胞凋亡，jiang和lytle等[1213]研究的药物干预引起的伴随bcl2下调的凋亡可能是由其他凋亡途径共同参与。经典线粒体凋亡途径，线粒体在受到凋亡刺激信号后，细胞色素c被释放，在存在datp时，细胞色素c激活apaf1；活化的apaf1又激活caspase9；后者引起caspase级联反应，最终导致caspase3的激活，完成细胞凋亡途径[14]。bcl2可通过阻止细胞色素c从线粒体释放抑制凋亡。由此，我们认为，bcl2基因沉默不直接诱导神经胶质瘤细胞凋亡发生，但可能可以增加细胞对凋亡刺激的敏感性。 wick等[15]报道bcl2可通过依赖furin样蛋白酶诱导胶质瘤细胞侵袭性增加。我们的研究发现相似结论。bcl2 sirna沉默bcl2基因表达后，实验组shg44和tj905细胞侵袭能力显著下降，穿膜细胞数较对照组和空白组明显减少。进一步分析发现这种侵袭能力的下降可能与bcl2基因沉默效率成正比，增加转染bcl2 sirna的剂量可进一步抑制实验组shg44和tj905细胞侵袭能力。 通过实验我们认为下调bcl2基因表达可有效抑制神经胶质瘤细胞增殖，降低其侵袭能力，但下调bcl2基因表达并不能诱导神经胶质瘤细胞凋亡。同时我们推测bcl2基因表达的下调可能可以增加细胞对凋亡刺激的敏感性，这为联合药物治疗中提高药物敏感性提供了理论基础，下一步将进行联合药物干预的处理，进一步论证该机制的可能性。
【参考文献】
［1］reed jc.bcl2: prevention of apoptosis as a mechanism of drug resistance [j].hematol clin north am,1995,9(2):451473.
[2]胡海燕,张洹.sirna 对神经胶质瘤细胞株u251 bcl2 基因表达的抑制[j].中国病理生理杂志,2005,21(3):489493.
[3]tsujimoto y,croce c.analysis of the structure,transcripts,and protein products of bcl2,the gene involved in human follicular lymphoma[j].proc natl acad sci usa,1986,83(17):52145218.
[4]fels c,schafer c,huppe b,et al.bcl2 expression in highergrade human glioma: a clinical and experimental study[j].j neurooncol,2000,48(3):207216.
[5]shinoura n,yoshida y,nishimura m,et al.expression level of bcl2 determines antior proapoptotic function[j].cancer res,1999,59（16）:41194128.
[6]何冬梅，张洹.bcl2反义寡核苷酸对人肺癌裸鼠移植瘤的抑制作用[j].癌症,2006,25(1):4044.
[7]nakasu s,nakasu y,nioka h,et al.bcl2 protein expression in tumors of the central nervous system[j].acta neuropathol,1994,88（6）:520526.
[8]krishna m,smith tm,recht ld.expression of bcl2 in reactive and neoplastic astrocytes: lack of correlation with presence or degree of malignancy[j].j neurosurg,1995,83（6）:10171022.
[9]holle l,hicks l,song w,et al.bcl2 targeting sirna expressed by a t7 vector system inhibits human tumor cell growth in vitro[j].int j oncol,2004,24(3):615621.
[10]he d,zhang y,and liu g.bcl2 sirna induces apoptosis and enhances the sensitivity to arsenic trioxide in nb4 cells[j].blood (ash annual meeting abstracts),2005,106（4）:4441.
[11]t futami,m miyagishi,m seki,et al.induction of apoptosis in hela cells with sirna expression vector targeted against bcl2[j].nucleic acids symp ser,2002,2（3）:251252.
[12]jiang h,zhang l,kuo j,et al.resveratrolinduced apoptotic death in human u251 glioma cells[j].mol cancer ther,2005,4（4）:554561.
[13]lytle ra,jiang z,zheng x,et al.retinamideinduced apoptosis in glioblastomas is associated with downregulation of bclxl and bcl2 proteins[j].j neurooncol,2005,74(3):225232.
[14]kwon kb,kim ek,han mj,et al.induction of apoptosis by radix paeoniae alba extract through cytochrome c release and the activations of caspase9 and caspase3 in hl60 cells[j].biol pharm bull,2006,29(6):10821086.
[15]wick w,wildbode c,frank b,et al.bcl2induced glioma cell invasiveness depends on furinlike proteases[j].j neurochem,2004,91(6):12751283.
