【关键词】hepg2细胞;环氧合酶-2；赛莱西布；增殖;凋亡
摘要：目的探讨选择性环氧合酶-2(cox-2)抑制剂赛莱西布(celecoxib)对人肝癌细胞株hepg2细胞增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制。方法用不同浓度的赛来西布处理hepg2细胞，分别应用四甲基偶氮噻唑蓝试验、dna梯度电泳法、放射免疫法检测赛亚西布对hepg2细胞增殖和凋亡及其cox-2活性的影响；应用免疫印迹法和比色法检测赛莱西布对hepg2细胞胱氨酸蛋白酶3(clasepase-3)蛋白质的表达及活性的影响。结果125，25，50μmol/l的赛莱西布作用于hepg2细胞后，hepg2细胞增殖受抑制，与对照组比较，差异有统计学意义(p<001)；赛莱西布干预组hepg2细胞dna明显降解，可见细胞凋亡特征性梯状dna条带；干预组hepg2细胞caspase3蛋白表达及活性均明显升高，与对照组比较，差异均有统计学意义(p<001)；赛莱西布明显抑制hepg2细胞cox-2活性，与对照组比较，差异有统计学意义(p<001)。结论赛莱西布可通过cox-2通路和caspase3通路抑制hepg2细胞增殖并诱导其凋亡。
关键词：hepg2细胞;环氧合酶-2；赛莱西布；增殖;凋亡
effectsofcyclooxygenase-2onproliferationandapoptosisinhepg2cells
yuhongping,chouxiaoqiang,zengxiaoyun,etal.
departmentofepidemiologyandstatistics,schoolofpublichealth,guangximedicaluniversity(nanning,530021,china)
abstract：objectivetoexaminetheeffectsofaselectiveinhibitorofcox-2,celecoxibongrowthandapoptosisinhepg2cells.methodshepg2cellsweretreatedwithvariousconcentrationsofcelecoxib.cellgrowthwasmeasuredbymtt,apoptosiswasdetectedbydnafragmentationassay,andcox-2activitywasmeasuredbyria;expressionofcaspase-3proteininhepg2cellswasdeterminedbywesternblot,andcaspase-3activitywasmeasuredusingcolorimetricassay.resultsafterhepg2cellsweretreatedwithdifferentconcentrationsofcelecoxib(12.5,25,50μmol/l),celecoxibcouldsignificantlysuppressthegrowthofhepg2cellsrespectivelycomparedwiththecontrolgroup(p<0.01),andcelecoxib-treatedhepg2cellsproducedadistinctoligosomalladder,thecharacteristicsofcellsundergoingapoptosis;meanwhile,thecaspas-3expressionandactivityofcelecoxibtreatedhepg2cellswereincreasedrespectivelyascomparedwiththecontrolgroups(p<0.01).furthermore,thelevelofcox-2activitywasreducedincelecoxib-treatedhepg2cellsrespectivelycomparedwiththecontrolgroup(p<0.01).conclusioncelecoxibcouldinhibittheproliferationandincreaseapoptosisinhepg2cellsbycox-2andcaspase3pathways.
keywords：hepg2cell;cyclooxygenase-2;celeeoxib;proliferation;apoptosis
近年来的研究表明，环氧合酶-2(cox-2)在结直肠癌、食管癌、肺癌等多种人类肿瘤组织中高表达〔1-3〕。WWw.11665.Com最新报道显示〔4，5〕，cox-2在肝癌组织中也高表达，并且在肝硬化组织中过表达，提示cox-2可能是肿瘤防治的一个新靶点〔3〕。非甾体类抗炎药(nonsteroidalanti-inflammatorydrugs，nsaids)具有预防和辅助治疗肿瘤尤其胃肠道肿瘤的作用〔6〕，但nsaids抑制肿瘤的作用机制尚不明确。本研究选择nsaids类药物中的1种高选择性cox-2抑制剂赛莱西布(赛来西布)，作用于人肝癌细胞株hepg2观察其对hepg2细胞增殖与凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。结果报告如下。
1材料与方法
11材料
111试剂赛莱西布(celecoxib，美国cayman公司)；四甲基偶氮噻唑蓝(mtt，上海华美生物工程公司)；二硫代苏糖醇(dtt，美国promega公司)；兔抗aspase-3抗体、兔抗人cox-2多克隆抗体(美国santacruz公司)；底物ac-devd-pna(n-acetyl-asp-glu-val-asp-p-nitroanilide)、核糖核酸酶-a(rnasea)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(hepes)、苯甲基磺酰氟(pmsf)、蛋白酶抑制剂(aprotinin，美国sigma公司)，rmpi-1640培养基、小牛血清美国gibco公司)；pge2放射免疫测定试剂盒(苏州大学医学院)。
112仪器5415r低温台式高速离心机(德国eppendorf公司)；hve50凝胶成像系统(美国syngene公司)；gs-930薄层扫描图像分析仪(日本岛津公司)；2123tc型co2培养箱(美国sheldon公司)；elx800酶标仪(美国bio-tek公司)。
12方法
121细胞培养人肝肿瘤细胞株hepg2由广西医科大学实验中心保存。hepg2细胞为贴壁细胞，用含10%小牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi-1640培养基在37℃、饱和湿度及5%co2的细胞培养箱内传代培养。
122mtt法测定赛莱西布对hepg2细胞增殖的影响用25g/l胰蛋白酶消化对数生长期的hepg2细胞制备单细胞悬液。以每孔5×103个细胞接种于96孔培养板，24h后换液，加入不同浓度赛莱西布使其终浓度分别为125，25，50μmol/l。设不进行药物干预的细胞为对照组。每种浓度平行4个复孔，继续培养。mtt法〔7〕测定赛莱西布对hepg2细胞增殖的影响。
123dna梯度电泳法检测hepg2细胞凋亡dna片断
将1×106个细胞接种于100ml培养瓶，细胞贴壁后换液，加入赛莱西布使其终浓度分别为125，50μmol/l。设不进行药物干预的细胞为对照组。继续培养48h，提取细胞基因组dna，应用dna梯度电泳法〔7〕检测hepg2细胞凋亡dna片断。电泳结果用hve50凝胶成像系统观察、分析、拍照。
124放射免疫法检测hepg2细胞cox-2活性前列腺素e2(pge2)是cox-2催化花生四烯酸产生前列腺素的主要产物，可用细胞分泌pge2的水平来反映cox-2的活性。因此，可采用赛莱西布对hepg2细胞分泌pge2的能力的影响来反它对cox-2活性的影响：以1×106/孔的密度将hepg2细胞接种于24孔板，24h后换培养基，设不进行药物干预的细胞为对照组，125，25，50μmol/l浓度的赛莱西布为干预组，每种浓度平行4复孔，继续培养24h后收集上清。按pge2放射免疫试剂盒说明测定pge2。
125hepg2细胞caspase-3活性的测定以1×106个细胞接种于100ml培养瓶，细胞贴壁后换液，加入赛莱西布使其终浓度分别为125，25，50μmol/l。设不进行药物干预的细胞为对照组。继续培养24h后，收集漂浮和贴壁的细胞，并加入预冷的细胞裂解液［50mmol/l的tris-cl,200mmol/l的nacl，2mmol/l的乙二胺四乙酸二钠盐(edta)，1%(v/v)tritonx-100、01mmol/l的pmsf］，冰上孵育10min后，以15000r/min离心5min(4℃)，取上清，并对其蛋白定量〔8〕。以细胞裂解液将待测样品蛋白浓度稀释至4g/l。反应体系含40μl待测样品、10μl的显色底物ac-devd-pna(20μmol/l)、50μl2×反应缓冲液［100mmol/l的hepes、2%(v/v)甘油、5mmol/l的dtt、05mmol/l的edta］，37℃水浴中避光孵育2h以上，以el×800酶标仪在450nm波长处测定样品a值，以不加底物样本作空白比色。caspase-3活性直接以a值表示。同时在赛莱西布作用细胞前2h预加入ac-devd-cho，2h后再加入赛莱西布使其终浓度分别为125，25，50μmol/l，以下处理和检测同上。
126westernblot检测hepg2细胞caspase-3蛋白质表达将1×106个细胞接种于100ml培养瓶，细胞贴壁后换液，加入不同浓度赛莱西布使其终浓度分别为125，25，50μmol/l。设不进行药物干预的细胞为对照组。继续培养48h后，用预冷的磷酸盐缓冲度(pbs)漂洗细胞，加入100μl预冷的细胞裂解液［50mmol/l的tris-cl,200mmol/l的nacl，2mmol/l的edta，1%(v/v)的tritonx-100、01mmol/l的pmsf］，于冰上孵育20min后，15000r/min4℃离心5min，提取蛋白，并测定蛋白含量〔8〕。以细胞裂解液将待测样品蛋白浓度稀释至4g/l。蛋白印迹(westernblot)法〔8〕检测hepg2细胞caspase-3蛋白质表达。用dab显色试剂盒显色，检测杂交信号，岛津cs-930薄层扫描图像分析仪计算蛋白条带的积分a值。
13统计分析应用spss100软件进行t检验。
2结果
21赛莱西布对hepg2细胞增殖的影响不同浓度赛莱西布作用于hepg2细胞72h后，125，25和50μmol/l干预组的a值分别为139±016，099±012，058±011，均显著低于与对照组a值243±026，差异有统计学意义(p<0001)。表明赛莱西布对hepg2细胞增殖有明显抑制作用，随着药物浓度增大，赛莱西布对hepg2细胞的增殖抑制作用更加明显。
22赛莱西布对hepg2细胞凋亡的影响(图1)图1可见，对照组hepg2细胞dna电泳主要表现为靠近加样孔附近完整的基因组dna，而赛莱西布干预组hepg2细胞dna明显降解，可见细胞凋亡的特征性梯状dna条带。
1：25μmol/l；2：空白对照；3：50μmol/l
图1不同浓度赛莱西布干预处理48h对hepg2细胞凋亡影响（略）
23赛莱西布对hepg2细胞caspase-3蛋白表达的影响westernblot检测结果显示，不同浓度的赛莱西布干预处理hepg2细胞48h，干预组hepg2细胞的capase-3的蛋白表达均明显升高，与对照组比较差异有统计学意义(p<001，图2，表1)。
1：空白对照；2：12.5μmol/l；3：25μmol/l;4：50μmol/l
图2赛莱西布对hepg2细胞caspase-3蛋白表达水平影响（略）
表1赛莱西布对hepg2细胞caspase-3蛋白表达水平的影响（略）
24赛莱西布对hepg2细胞caspase-3活性的影响125，25和50μmol/l干预组caspase-3活性分别为024±0013，044±0016，071±009，均高于与对照组caspase-3活性001±0012，差异有统计学意义(p<0001)，表明赛莱西布可诱导hepg2细胞caspase-3活性的升高。进一步用caspase-3特异性抑制剂ac-devd-cho先于赛莱西布与细胞作用，2h后再加入赛莱西布作用24h，发现赛莱西布中ac-devd-chd处理组hepg2细胞caspase-3活性显著低于赛莱西布组，表明ac-devd-cho能抑制赛莱西布诱导hepg2细胞的凋亡。
25赛莱西布对hepg2细胞cox-2活性的影响125，25和50μmol/l干预组前列腺素e2(pge2)水平(pg/(ml・106cells)分别为3610±435，2627±366和1765±273，均显著低于与对照组11228±871，差异有统计学意义(p<0001)，表明赛莱西布可明显抑制hepg2细胞pge2释放水平。随着药物浓度的增加，pge2释放水平逐渐下降，表明赛莱西布可抑制hepg2细胞cox-2活性。
3讨论
本研究发现，用不同浓度赛莱西布作用于hepg2细胞后，对细胞生长增殖有明显抑制作用
，并且随着浓度的增大，这种抑制作用更明显，呈一定的剂量依赖关系。用dna梯度凝胶电泳法观察赛莱西布对hepg2细胞凋亡的影响，发现赛莱西布干预组的细胞基因组dna电泳表现为特征性的梯形条带，说明cox-2参与了hepg2细胞凋亡过程。放射免疫法检测显示，hepg2细胞培养上清中有pge2的释放，赛莱西布可明显抑制hepg2细胞pge2释放水平，减少pge2产生。而pge2是cox-2催化花生四烯酸产生pgs的主要产物，说明赛莱西布可能通过抑制cox-2酶催化活性而减少pge2产生，从而抑制hepg2细胞增殖，诱导其凋亡。本研究发现，赛莱西布以剂量依赖性方式诱导hepg2细胞caspase-3蛋白表达水平显著增加，其活性也明显升高，提示caspase-3活化介导了赛莱西布诱导的hepg2细胞凋亡。为进一步证实上述结论的可靠性，本研究用caspase-3特异性抑制剂ac-devd-cho预先作用于hepg2细胞，再施以赛莱西布干预。结果显示，当封闭caspase-3的裂解激活，相同浓度赛莱西布诱导的hepg2细胞凋亡明显受到抑制。提示赛莱西布可通过激活caspase-3而诱导肿瘤细胞凋亡。本研究结果显示，赛莱西布可通过cox-2通路和caspase-3通路抑制hepg2细胞增殖并诱导其凋亡。最近，ferrandina〔9〕等对14例患有头颈部癌的病人给予短时期的赛莱西布处理后，病人平均cox-2表达水平显著降低，ki67明显下降，肿瘤组织微血管密度值明显降低。结合本研究结果，提示选择性cox-2抑制剂是一种有应用前景的肝癌预防和治疗的化学药物。
参考文献
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