【摘要】 目的: 探索hmgb1是否参与淋巴细胞免疫功能的调节。方法: 系列浓度hmgb1单独或与cona联合刺激培养小鼠脾淋巴细胞。mtt法检测细胞增殖, 流式细胞术（fcm）检测细胞凋亡、 细胞表面cd3、 cd8及细胞内il-4、 ifn-γ表达。结果: （1）hmgb1时间-剂量依赖性调节淋巴细胞增殖, 而不影响其凋亡。（2）不同hmgb1浓度和刺激时间不影响淋巴细胞th1、 th2及th1/th2变化, 但10 μg/l和100 μg/l hmgb1刺激12~24 h, th1亚群占优势; 培养12~24 h, 淋巴细胞tc1亚群明显减少, tc2无变化。tc1/tc2变化显示, 1 μg/l和10 μg/l hmgb1刺激, tc1亚群占优势。（3）培养12~24 h, 上清中il-2增加, sil-2r减少, il-2/sil-2r比例升高20~50倍, 尤以10 μg/l hmgb1刺激明显。结论: 低剂量hmgb1可增强淋巴细胞免疫功能。
【关键词】 高迁移率族蛋白b1 淋巴细胞 t细胞亚群 白细胞介素-2
effect of high mobility group box 1 protein on proliferation and apoptosis and balance between th1/th2 and tc1/tc2 of lymphocytes in vitro
wang zhong-tang, yao yong-ming, sheng zhi-yong
department of plastic surgery, zhongshan hospital, xiamen university, xiamen 361004, china
［abstract］ aim: to explore whether extracellular high mobility group b1 protein (hmgb1) plays a role in regulation of lymphocyte-mediated immune. methods: lymphocytes originated from mice spleens were stimulated with concentration gradient hmgb1 or combined with cona in vitro. then, the proliferation of lymphocytes was assayed with mtt, quantitative and qualitative analysis of apoptosis in lymphocytes and expression of cd3 and cd8 on cells surface and il-4 and ifn-γ within cells were assessed using flow cytometry. levels of interleukin-2 (il-2) and soluble il-2r (sil-2r) of culture supernatant were assayed by elisa. results: (1) hmgb1 regulated the proliferation of lymphocytes in a time- and dose-dependent manner, but did not influence the apoptosis of lymphocytes. (2) the ratio of th to tc increased from 2.6∶1 at culture-hour 0 to 5-7: 1 at culture-hour 12 and 24, but that did not change with the stimulation of hmgb1. there were no significant difference in the population and percentage of th1 and th2, as well as tc1 and tc2, when stimulated with hmgb1. however, hmgb1 in concentrations of 10 and 100 μg/l favored th1 differentiation, and 1 and 10 μg/l hmgb1 favored tc1 differentiation. (3) levels of il-2 were increased, and sil-2r decreased, significantly, when stimulated with 10 μg/l hmgb1 for 12 h, thus the ratio of il-2 to sil-2r was markedly higher, as compared with 0 and 1000 μg/l hmgb1 (p<0.05 or p<0.01). conclusion: low dose hmgb1 could be in favor of the bias of th1 and tc1, and improve the lymphocyte-mediated immune.
［keywords］high mobility group box 1; lymphocyte; t-lymphocyte subsets; interleukin-2
高迁移率族蛋白b1（high mobility group box 1, hmgb1）为mr 30000的非组dna结合蛋白, 因其在凝胶电泳时泳动速度快而得名。wWw.133229.CoM近年研究发现, 多种因素可诱导hmgb1从核内转移至胞外［1］, 发挥典型促炎效应［2］。因较tnf-α、 il-1β等早期释放的炎性因子产生迟且持续高水平释放时间持久, 国内外学术界将hmgb1称为“晚期”炎性介质［3］。既往炎性因子拮抗方案临床应用失败, 促使人们把hmgb1等分泌较晚、 体内持续时间较长、 且与临床脓毒症患者死亡时相接近、 临床治疗“窗口”较宽炎症因子作为新的干预目标［4］。目前, 细胞外hmgb1的功能研究多集中在其促炎效应方面, 而尚无其与淋巴细胞增殖、 凋亡及th1/th2和tc1/tc2漂移间关系的报导［5, 6］。现已明确, 淋巴细胞介导细胞免疫应答的性质和程度主要体现在某亚群细胞数量增减和分泌细胞因子类别及量的变化［7］。因此, 试验重点观测hmgb1对体外淋巴细胞增殖、 凋亡和il-2、 il-4、 ifn-γ等细胞因子分泌的影响, 探讨hmgb1是否诱发免疫功能紊乱。
1 材料和方法
1.1 材料 培养液rpmi1640为gibco/brl产品。hmgb1、 刀豆素a、 噻唑兰（mtt）、 brefeldin a、 离子霉素、 佛波醇乙酯（pma）, 购自sigma公司。抗小鼠单克隆抗体(mab) cy-chrome-cd3、 fitc-cd8a、 apc-il-4及apc-rat igg1同型对照、 fitc-cd4、 r-pe-ifn-γ及r-pe- rat igg1同型对照, rat anti-mouse cd16/cd32 (fcγⅲ/ⅱ-r)抗体, 固定/破膜剂, 均购自bd pharmingen公司。annexin-ⅴ细胞凋亡检测试剂盒为北京宝赛生物产品。小鼠il-2检测elisa试剂盒为法国diaclone产品。小鼠sil-2r检测elisa试剂盒为美国lifekey biomeditech产品。流式细胞分析仪（facs/calibur）为becton-dickinson产品。
1.2 方法
1.2.1 淋巴细胞分离纯化 balb/c小鼠禁食8 h, 常规方法分离纯化脾淋巴细胞, 台盼蓝拒染率>95%。
1.2.2 hmgb1与cona混合刺激分组 淋巴细胞调整至3×109/l, 入96孔培养板, 0.2 ml/孔, 37℃ 50 ml/l co2孵箱孵育8 h。再加入终浓度0、 1、 10、 100、 1000 μg/l hmgb1及4 mg/l cona（预实验优化）, 每浓度4个平行孔, 分别培养24、 48、 72、 96 h, mtt法检测淋巴细胞增殖情况。上述试验重复3次。
1.2.3 hmgb1单独刺激分组 淋巴细胞调整至3×109/l, 入24孔培养板, 1ml/孔, 及终浓度0、 1、 10、 100、 1000μg/l hmgb1, 每浓度2个平行孔, 分0.5、 2、 6、 12、 24、 48、 72、 96 h时相组。培养至相应时间, 收集上清和细胞。细胞经1000 r/min, 离心5 min, 洗涤2次, 台盼蓝染色判断活率, 调整至3×109/l, mtt法检测淋巴细胞增殖情况。另收集0、 12、 24 h时相细胞及上清, 用于检测细胞凋亡、 细胞表面cd3/cd8a和细胞内il-4/ifn-γ表达及il-2和sil-2r分泌。重复上述试验3~6次。
1.2.4 mtt法检测淋巴细胞增殖 方法同参考文献［10］。
1.2.5 淋巴细胞凋亡检测 完全按annexin-ⅴ细胞凋亡检测试剂盒说明书操作, 每份标本检测20000个细胞。
1.2.6 淋巴细胞内细胞因子与细胞膜表面抗原fcm分析 按照细胞内细胞因子染色试剂盒说明书操作。细胞活化阶段,加入终浓度pma 25 μg/l、 离子霉素500 μg/l、 brefeldin a 10 mg/l; 阻断fc受体时, 加抗fcγⅱ/ⅲ受体抗体1 μg; 细胞表面抗原染色时, 分别加0.4 μg cy-cd3抗体和fitc-cd8a抗体; 细胞因子染色时, 分别加0.25 μg apc-il-4抗体及同型对照和pe-ifn-γ抗体及同型对照。上机检测时, 以未染色和同型对照作阴性对照, 每份标本检测50000个细胞。
1.2.7 培养上清il-2、 sil-2r检测 完全按elisa试剂盒说明书操作。
1.2.8 统计学处理 在统计软件stata 7.0上运行, 采用两因素或单因素方差分析和t检验。
2 结果
2.1 hmgb1与cona联合对淋巴细胞增殖影响 两因素方差分析显示, hmgb1与cona联合, 不同hmgb1浓度（p<0.01）和刺激时间（p<0.01）均影响淋巴细胞增殖。单独cona刺激24 h, 细胞增殖能力最强, 96 h时相, 增殖能力急剧降低（p<0.01）。与单独cona刺激组（0 μg/l hmgb1）相比, 联合 1、 10、 100 μg/l hmgb1刺激, 淋巴细胞增殖无变化, 但48、 96 h时相, 1000 μg/l hmgb1组细胞增殖明显减弱（p<0.05, 表1）。
表1 hmgb1与cona联合刺激后脾淋巴细胞增殖情况（略）
tab 1 changes in splenocytes proliferation stimulated with cona and different concentrations of hmgb1
p<0.05 vs 1000 μg/l group.
2.2 hmgb1单独对淋巴细胞增殖影响 两因素方差分析显示, 不同刺激时间明显影响淋巴细胞增殖（p<0.01）, 而不同hmgb1浓度对细胞增殖无明显影响（p>0.05）。剂量组间相比, 刺激0、 0.5、 2 h, 各剂量组间淋巴细胞增殖功能无明显差异; 6 h时相, 10 μg/l组淋巴细胞增殖明显恢复; 12 h时相, 100 μg/l组增殖功能最强; 而24 h时相, 1 μg/l组增殖功能最强; 48~72 h间, 各剂量组间差异无统计学意义。
2.3 hmgb1对淋巴细胞凋亡影响 培养12~24 h后, 细胞死亡率增加。24 h时相, 10 μg/l组较1 μg/l组细胞凋亡数量明显增多（p<0.01, 表2）。
表2 hmgb1刺激后淋巴细胞死亡和凋亡情况（略）
tab 2 changes in apoptosis of splenocytes stimulated with hmgb1
p<0.01 vs 10 μg/l group.
2.4 hmgb1对淋巴细胞th/tc亚群影响 正常小鼠脾淋巴细胞th/tc亚群比例2.6∶1, 而培养12~24 h, 该比例升至5~7∶1（p<0.01）; 不同浓度hmgb1刺激对淋巴细胞亚群th/tc比例无影响（p>0.05）。
2.5 hmgb1对淋巴细胞th1/th2漂移影响 两因素方差分析显示, 不同刺激时间未能影响淋巴细胞亚群th1、 th2及th1/th2（p>0.05）; 同样, 不同刺激浓度也未能影响th1、 th2及th1/th2（p＞0.05）。另, 10、 100 μg/l hmgb1刺激12 h, th1/th2比值分别为288±351、 206±167, 0、 1、 1000 μg/l组分别为110±37、 62±55、 127±84, 提示10、 100 μg/l hmgb1组th1亚群占优势; 刺激24 h, 该趋势持续存在。
2.6 hmgb1对淋巴细胞tc1/tc2漂移影响 两因素方差分析显示, 培养12~24 h淋巴细胞tc1亚群明显减少（p<0.01）, 而不影响tc2及tc1/tc2（p>0.05）; 不同刺激浓度对淋巴细胞tc1、 tc2及tc1/tc2无影响（p>0.05）。另, hmgb1刺激12 h, 10 μg/l组tc1/tc2比值为256±6, 0、 1、 100、 1000 μg/l组分别为18 ±11、 51±49、 47±22、 44±37, 提示10 μg/l hmgb1刺激12 h有助于淋巴细胞向tc1亚群分化; hmgb1刺激24 h, 1 μg/l组tc1/tc2比值为125±133, 0、 10、 100、 1000 μg/l组分别为36±30、 54±45、 76±80、 50±17, 提示刺激24 h, 1 μg/l hmgb1有助于淋巴细胞向tc1亚群分化。
2.7 hmgb1对淋巴细胞培养上清il-2和sil-2r影响 细胞培养后上清中il-2浓度增加10~20倍, sil-2r浓度降低, il-2/sil-2 r比值升高20~50倍。12 h时相, 0、 1 μg/l组间il-2、 sil-2r及il-2/sil-2r水平接近; 10、 100 μg/l组il-2浓度较0 μg/l组高50%（p<0.05）; 10 μg/l组sil-2r浓度较0、 1000 μg/l组明显降低（p<0.05或p<0.01）, 同时, 10 μg/l组il-2/sil-2r比值明显高于0、 1000 μg/l组（p<0.01）。24 h时相, 各剂量组间il-2、 sil-2r浓度及il-2/sil-2r比值差异无统计学意义（表3）。
表3 hmgb1刺激淋巴细胞il-2和sil-2r产生情况（略）
tab 3 changes in production of il-2 and sil-2r in lymphocytes stimulated with hmgb1
ap<0.05, bp<0.01 vs 0 μg/l group; cp<0.05 vs 100 μg/l group; dp<0.01, ep<0.05 vs 1000 μg/l group.
3 讨论
外来因素刺激淋巴细胞, 其效应可由细胞数量增减体现［7］。mtt法和fcm可定量分析细胞增殖和凋亡情况。另外, 为避免沾染内毒素激活b淋巴细胞, 进而影响t细胞功能, 培养体系常规加入10 mg/l多黏菌素b。结合hmgb1与con a联合或单独刺激对淋巴细胞增殖功能干预情况, 以及不同培养时相细胞台盼蓝拒染观测, 我们初步得出如下认识: （1）0.5~2 h, 淋巴细胞体外适应阶段, 似乎高浓度hmgb1利于淋巴细胞增殖功能恢复; （2）6~12 h, 淋巴细胞基本适应体外环境, 10~100 μg/l hmgb1明显促进淋巴细胞增殖; （3）24 h, 1~10 μg/l hmgb1明显促进淋巴细胞增殖; （4）48~96 h, 淋巴细胞死亡增多, 参考价值不大。此外, 细胞凋亡检测显示, 各剂量组间凋亡或坏死细胞数基本无差异, 提示hmgb1可能不通过细胞凋亡环节调节淋巴细胞增殖效应。
本试验中采用四色fcm检测单个t淋巴细胞内il-4和ifn-γ表达情况, 定量观察hmgb1刺激后th/tc亚群变化。结果显示, 1~1000 μg/l hmgb1刺激, 淋巴细胞th1、 th2和th1/th2均无明显变化, 但10、 100 μg/l组, 始终以th1亚群占优势。此外, 体外培养导致tc1明显减少, tc2增多, 培养至24 h, tc1比例也逐渐增多, 提示体外培养环境本身即可诱导tc0向tc2分化, 及tc1向tc2漂移,随着t细胞逐步适应培养环境, tc1/tc2比例再次趋于平衡, 同时, 我们注意到培养体系中加入不同浓度hmgb1均有助于维护tc1/tc2比例平衡。另外, 低浓度hmgb1（1或10 μg/l）刺激, tc1/tc2比例增加, 即有助于向tc1亚群漂移。现已明确, 调节th1和th2增殖、 分化因素主要包括细胞因子、 激素、 抗原和抗原提呈细胞及协同刺激分子及其他一些转录水平因子参与［8］。th1/th2偏移导致机体免疫功能过强或低下, 并表现为多种疾病形式, 而恢复th1/th2平衡, 则疾病预后改善［9］。我们其他试验证实（结果未发表）, 低剂量hmgb1导致体内外腹腔巨噬细胞吞噬功能增强、 mhc-ⅱ类分子表达上调, 高剂量hmgb1则抑制小鼠腹腔巨嗜细胞吞噬功能、 下调mhc-ⅱ类分子表达。提示hmgb1至少可通过抗原提呈细胞及协同刺激分子途径参与th1/th2、 tc1/tc2亚群调节。低剂量hmgb1对淋巴细胞il-2分泌有促进作用, 而大量产生的il-2将促使th0、 th2及tc0、 tc2向th1、 tc1漂移, 同时, th1和tc1亚群增加会促进il-2产生, 将在一定范围内形成正反馈。此外, hmgb1也可能通过调节淋巴细胞增殖途径影响培养体系内il-2变化, 因低剂量hmgb1能增强淋巴细胞增殖功能, 而高剂量hmgb1却抑制淋巴细胞增殖。依据“存在就是合理的”理论, 对细胞外hmgb1的作用存在争议, 并提出“hmgb1可能为内源性免疫调节因子”假说, 在机体非细菌性免疫反应中发挥作用［10］。
我们的研究证实低剂量hmgb1能促进淋巴细胞免疫功能, 而完全拮抗hmgb1将可能恶化脓毒症免疫紊乱状态。至于hmgb1与正常或病理状态下机体免疫系统间关系及作用机制如何仍待深入探讨。
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