【关键词】 硫氧还蛋白；再灌注；心肌梗塞；细胞凋亡
effects of human thioredoxin on infarction size and apoptosis induced by ischemia/reperfusion in rats/wu xiao|wei, zhang yi|na, teng zong|yan, jiang li|hong, fan ying, hu ping|ping//chinese journal of cardiovascular rehabilitation medicine,2008,18(1):26
abstract：objective:this study was conducted to explore the role of human thioredoxin on myocardial ischemia/reperfusion injury and its potential mechanisms.methods:the wister rats randomly divided into three groups: sham group（8 cases）, ischemia/reperfusion （i/r）group （wister rats were suffered to 30 min of myocardial ischemia followed by 120 min of reperfusion, 8 cases）, and thioredoxin group （purified human thioredoxin was injected into adult wister rats treated as same as group i/r, 5 cases）. at the end of study, the infarct size was determined by tetrazolium chloride staining, cardiomyocyte apoptosis was detected by tdt mediate dutp nick end labeling (tunel) assay, and the protein expression of bcl-2 and bax in myocardium were assayed by immunochemistry. results:human thioredoxin reduced myocardial ischemia/reperfusion injury as evidenced by significant decrease of myocardial infarct size(p<0.01) and notable reduction of cardiomyocyte apoptosis(p<0.01). furthermore, human thioredoxin markedly increased protein expression of bcl-2(p<0.05).conclusion:these results strongly suggest that human thioredoxin has effects on antimyocardial ischemia/reperfusion and its anti-apoptotic role is mediated, at least in part, by up-regulation of bcl-2.
author′s address：department of geriatrics, the second affiliated hospital, harbin medical university, harbin，heilongjiang,150086, china
key words：thioredoxin;reperfusion;myocardial infarction;apoptosis 缺血再灌注(ischemia/reperfusion, i/r)损伤有着十分复杂的病理生理过程，越来越多的证据表明氧化应激、凋亡机制和炎性反应共同参与了i/r后心肌细胞的死亡和心肌再灌注后梗塞范围的扩大[1～3]。wWW.133229.cOM硫氧还蛋白（thioredoxin, trx）是机体最重要的氧化还原调节蛋白之一，近年来许多证据表明trx尚具有抑制凋亡、促进生长和对炎症反应进行调解等作用[4～6]。本实验从大鼠股静脉注射人重组人硫氧还蛋白(human thioredoxin, htrx)，观察其对i/r后心肌梗塞范围和心肌细胞凋亡的影响。
1 资料与方法
1.1 htrx的纯化和检测 诱导含有pqe32/trx质粒的e.coli.m15（由滕宗艳博士提供，哈尔滨医科大学附属二院）表达htrx, 按照说明书用his bind column纯化融合蛋白。以免疫印迹技术鉴定纯化的htrx，一抗鼠抗htrx抗体(santa cruz, ca)，二抗马抗鼠igg抗体(promega)，dab(santa cruz, 美国)显色。用考马斯亮蓝检测试剂盒检测蛋白浓度。
1.2 心肌缺血再灌注模型 成年wister大鼠［体重（200±10）g，由哈尔滨医科大学附属二院动物实验中心提供］60只，预实验26只，其余44只随机分为ⅰ假手术组（sham组），ⅱ缺血再灌注组（i/r组），ⅲ 人重组人硫氧还蛋白保护组（htrx组），实验成功的大鼠ⅰ、ⅱ、ⅲ组分别为8、7、6只。根据文献[7]的方法制作动物模型，缺血30min后再灌注120min，再灌注后立即静脉注射磷酸盐缓冲液（pbs）或htrx（1mg/kg）。sham组只穿线不结扎。所有实验动物（行心肌梗塞范围测定的除外）均he染色，判定模型建立情况，成功者继续实验。
1.3 心肌梗塞范围的确定 于再灌注结束后,将冠状动脉左前降支原位重新结扎,从颈动脉注入1%伊文思兰5 ml, 待缺血区显示清晰后立即摘除心脏,冰冷生理盐水冲洗, 20℃冰箱冷冻10 min,作垂直左室长轴2 mm厚连续切片,1%氯化四唑（ttc）染色30 min, 10%甲醛固定后,称重法测定心肌缺血危险区和梗塞区心肌重量,以梗塞区重量占缺血心肌重量的百分比表示心肌梗塞范围。
1.4 组织学和心肌细胞凋亡检测 术后取部分缺血区心肌组织, 4%甲醛溶液中固定24 h,常规石蜡包埋、切片，分别行常规he染色和心肌细胞凋亡检测以及免疫组化检测。采用末端脱氧核苷酸转移酶(tdt酶)介导的脱氧尿嘧啶（dutp）缺口末端标记（tunel)法检测凋亡心肌细胞。光镜下正常心肌细胞核染成蓝色，凋亡的细胞核呈棕褐色（tunel阳性），每张切片在凋亡细胞阳性区域随机取10个以上的高倍视野。数不少于100个心肌细胞核，计算凋亡率。公式如下：凋亡指数（ai，%)=(凋亡细胞数/100)×100%，以上采用盲法分析。
1.5 凋亡调节基因bcl-2、bax表达产物的检测 免疫组化法检测bcl-2 和bax蛋白的表达：按免疫组化试剂盒(sabc kit, boster, china)说明书操作，一抗bcl-2或bax(boster, china),二抗生物素化羊抗兔抗体(boster, china)。bcl-2和bax阳性细胞：胞质呈棕黄色。以olympus u-pmtvc显微镜 (olympus inc, japan), jvc 数码相机 (jvc, japan) 于每张切片缺血部位随机选取10 个高倍视野拍照,以motic image program (motic china group co., ltd)分析，以上为盲法分析。
1.6 统计学分析 各组实验数据以均数±标准差(±s)表示，采用spss 13.0软件包进行统计分析。组间比较采用t检验，p<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 western免疫印记技术检测htrx western 印迹检测htrx 结果如图1所示。纯化后的htrx经浓缩浓度为0.37mg/ml。图1 western印迹鉴定人重组硫氧还蛋白（htrx）
2.2 模型的建立 如图2a所示，he染色sham组心肌细胞排列紧密，胞质丰富，红染。高倍镜下横纹清晰，可见润盘。胞核卵圆形，位于细胞中央，染色质清晰可见。心肌纤维之间有薄层结缔组织。i/r组缺血区心肌细胞肿胀,横纹模糊不清,胞质颗粒变性，胞核浓聚。htrx保护组较模型组心肌损伤明显减轻。心肌细胞排列紧密。根据he染色实验动物造模情况见表1。 表1 实验动物造模情况假手术组缺血再灌注组人重组硫氧
2.3 htrx 对缺血再灌注后心肌梗塞面积的影响 如图3所示，i/r后模型组心肌梗塞范围显著增大（p<0.01），htrx治疗显著减小了缺血再灌注120min所产生的心梗范围（p<0.01）。
2.4 htrx对心肌细胞凋亡的影响 我们采用tunel标记大鼠心肌，研究htrx是否能降低缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡，结果发现i/r明显增加了心肌凋亡细胞的数量(51.57±4.73）%∶（11.19±1.88）%, p<0.01)， htrx保护组的大鼠心肌虽然仍有较高的ai，但与i/r组比较显著降低了再灌注后心肌细胞的凋亡(42.49±2.52）%,p<0.01(图2b)。
2.5 htrx对i/r后心肌细胞bcl-2和bax表达的影响 免疫组化染色显示i/r120min后bcl-2蛋白表达尚无明显变化，htrx的应用显著增加了再灌注120min后bcl-2蛋白的表达(p<0.05），见图4。与之相反，i/r显著增加了bax的表达(p<0.05）, 然而，htrx未能显著降低bax的表达（p＝0.58）。 图4 htrx对i/r2h后心肌细胞bcl2表达的影响（×200，细胞浆棕色为bcl-2阳性细胞）
3 讨 论
trx是一种普遍存在的小分子(大约12 kda)多功能硫基蛋白，它们在进化上相当保守,一般都具有一个相同的有氧化还原活性的cys-gly-pro-cys 的氨基酸序列[8]。作为体内最重要的氧化还原调节蛋白之一，trx由缺氧/缺血诱导产生[9]，并能保护细胞抵御各种氧化应激[10,11]。 在本实验中，我们研究了htrx对i/r心肌的保护作用。研究发现htrx不仅降低了再灌注后的心肌梗塞范围而且还显著减少了心肌细胞凋亡的数量，结果进一步证实了htrx有抗i/r损伤的作用[12]。此外， htrx上调bcl-2的表达可能是其抗凋亡作用的机制。 来自临床和实验室越来越多的证据表明心肌i/r不仅产生组织坏死，还出现细胞凋亡[13～15]。我们的试验进一步证实了这一观点，i/r组不仅出现明显的梗塞，而且凋亡细胞的数量较假手术组也显著增多。再灌注后htrx的应用则显著减低了心肌细胞的凋亡。我们初步探讨了在i/r过程中htrx抗凋亡的作用机制。心肌i/r过程中细胞凋亡的发生受细胞周围刺激信号的诱导并受到特定的基因调控。bcl-2家族是重要的凋亡调节基因，它在线粒体信号传导的细胞凋亡通路中起着重要的调节作用。bcl-2家族蛋白由抗凋亡和促凋亡成员组成，这些成员之间通过相互协同作用调节了线粒体结构与功能的稳定性，并通过控制线粒体凋亡因子,如细胞色素c和凋亡诱导因子(apoptosisinducing factor，aif)等的释放而决定细胞的生死。bcl-2是典型的抗凋亡基因，其表达的bcl-2蛋白能抑制多种因素介导的细胞凋亡，如钙超载、糖撤退、膜过氧化和自由基损伤[16]。心肌组织缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡也与bcl-2基因表达下调有关。而bax作为促凋亡蛋白常位于胞浆中，当细胞处于应激状态时，bax移位到线粒体膜上促进凋亡的发生。为了研究i/r过程中htrx对bcl-2和bax的影响，我们分析了各组bcl-2和bax的表达。结果发现htrx显著增加了i/r后bcl-2蛋白的表达，对bax蛋白表达却没有显著影响。由此可见，htrx在缺血再灌注过程中对bcl-2家族蛋白具有调节作用，且主要通过上调bcl-2的表达来抑制再灌注后心肌凋亡的发生。
【参考文献】
[1]eefting f, rensing b, wigman j, et al.role of apoptosis in reperfusion injury［j］.cardiovase res,2004,61：414-426.
[2]misra a, haudek sb, knuefermann p, et al.nuclear factorκb protects the adult cardiac myocyte against ischemia|induced apoptosis in a murine model of acute myocardial infarction［j］.circulation,2003,108：3075-3078.
[3]masutani h, bai j, kim yc, et al.thioredoxin as a neurotrophic cofactor and an important regulator of neuroprotection［j］.mol neurobiol,2004,29:229-242.
[4]nakamura h, de rosa sc, yodoi j, et al.chronic elevation of plasma thioredoxin：inhibition of chemotaxis and curtailment of life expectancy in aids［j］.proc natl acad sci usa,2001,98:2688-2693.
[5]watson wh, yang x, choi ye, et al.thioredoxin and its role in toxicology［j］.toxicol sci,2004,78：3-14.
［6］郑 直，李翠云，翁锦龙.大剂量维生素c对心肌缺血/再灌注损伤中txa2水平的影响［j］.心血管康复医学杂志，2003，12(4)：310-313.
[7]王淑侠，兰小莉，王吉文,等.大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型的改进与评价［j］.解剖科学进展,2004,16（4）:371-373.
[8]holmgren a.thioredoxin［j］.annu rev biochem,1985,54：237-271.
[9]berggren m, gallegos a, gasdaska jr, et al.thioredoxin and thioredoxin reductase gene expression in human tumors and cell lines, and the effects of serum stimulation and hypoxia［j］.anticancer res,1996,16:3459-3466.
[10]sasada t, iwata s, sato n, et al. redox control of resistance to cis|diamminedichloroplatinum (ⅱ) (cddp)：protective effect of human thioredoxin against cddp-induced cytotoxicity［j］.clin invest,1996,97：2268-2276.
[11]takagi y, mitsui a, nishiyama a, et al.overexpression of thioredoxin in transgenic mice attenuates focal ischemic brain damage［j］.proc natl acad sci usa,1999,96：4131-4136.
[12]tao l, gao e, bryan ns, et al.cardioprotective effects of thioredoxin in myocardial ischemia and reperfusion：role of s-nitrosation［j］.proc natl acad sci usa,2004,101：11471-11476.
[13]maulik n, yoshida t, engelman rm, et al.ischemic preconditioning attenuates apoptotic cell death associated with ischemia/reperfusion［j］.mol cell cardiol,1998,186:139-145.
[14]yeh eth.life and death in the cardiovascular system［j］.circulation,1997, 95：782-786
［15］樊泽元，杨 光，杨新春.缺血后处理——心脏再灌注保护新策略［j］.心血管康复医学杂志，2007，16(6)：609-612.
[16]zhong lt, sarafian t, kane dj, et al.bcl-2 inhibits death of central neural cells induced by multiple agents［j］.proc natl acad sci usa,1993,90：4533-4537.
