【关键词】 心肌梗死;缺血再灌注损伤;糖尿病;livin
【摘要】 目的 观察转染livin对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注过程中livin、caspase3表达以及心肌细胞凋亡和心肌梗死范围的影响。方法 健康sd大鼠80只，应用小剂量多次链脲佐菌素(stz)注射法建立2型糖尿病大鼠模型，随机选取60只大鼠分为假手术组、缺血再灌注(ir)组、空载体组和livin组。假手术组不结扎冠状动脉;livin组开胸心肌内注射表达livin的逆转录病毒载体，24 h后行ir;空载体组开胸注射空载体，24 h后行ir。荧光定量pcr测定caspase3 mrna，livin mrna表达，用ttc染色法测定梗死范围，tunel 法测定凋亡心肌细胞。结果 ①荧光定量pcr检测到糖尿病大鼠心肌细胞有livin表达，空载体组及ir组livin表达均不增加;转染livin后大鼠心肌内livin表达明显增加(p<0.01)。②ir组caspase3表达明显增加，显著高于假手术组(p<0.01);与ir组相比，livin组caspase3 mrna表达水平显著降低(p<0.01)。③livin组心肌梗死范围较ir组显著减少(p<0.05)。④tunel法检测显示糖尿病大鼠ir过程中可见心肌细胞凋亡的发生，ir组较对照组显著增加(p<0.05);注射livin后则细胞凋亡的发生明显减少，与ir组比较差异显著(p<0.05)。WWW.133229.COm结论 心肌livin过表达可以抑制糖尿病大鼠心肌caspase3表达，抑制ir过程中心肌细胞凋亡的发生，缩小心肌梗死范围。
【关键词】 心肌梗死;缺血再灌注损伤;糖尿病;livin
糖尿病是冠心病独立危险因素，心肌细胞凋亡是引发糖尿病缺血性心脏疾病发生与发展的主要因素。急性心肌梗死(ami)合并糖尿病人群的死亡率也高于非糖尿病人群。ami后再灌注治疗可造成心肌缺血再灌注损伤(iri)细胞凋亡与心肌iri有关，如能抑制心肌细胞凋亡，则可以保护缺血心肌。caspase3是细胞凋亡调控的重要因子，livin是近年发现的凋亡抑制蛋白家族(iaps)的新成员，本研究拟转染表达livin的逆转录病毒载体对糖尿病大鼠心肌iri的影响及其机制，为临床治疗iri提供新的思路。
1 资料与方法
1.1 实验材料
工具酶及禽源性逆转录酶amv购于promega公司;marker dl2000购自takara公司;rna提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自qiagen公司;胎牛血清购自hyclone公司，链脲佐菌素(stz)、氯化三苯基四氮唑(ttc)和伊文氏蓝均购自sigma公司，fugene6(transfection reagent)转染试剂盒及细胞凋亡原位检测(tunel)试剂盒购于roche公司。表达livin的逆转录病毒载体由郑州大学基础医学院赵国强教授提供。
1.2 动物模型的建立
sd大鼠80只，体质量(250±50) g，由河南省实验动物中心提供，以高脂高糖饲料喂养(其中含10%蔗糖，10%猪油，5%胆固醇)，4 w后空腹腹腔一次性注射以柠檬酸缓冲液配制的1%stz溶液，剂量为40 mg/kg。继续高糖高脂饲料喂养，于注射后1、2个月测定体重和血糖。选择非空腹血糖16.7～25.6 mmol/l的大鼠作为造模成功的糖尿病大鼠。经检测模型成功大鼠共66只，随机选取其中60只大鼠,并分为缺血再灌注(ir)组，空载体组，livin组和假手术组，每组15只。ir组结扎左冠状动脉前降支(lad)，以结扎后心电图ⅱ导联st段抬高，相关缺血区域变苍白为成功。30 min后松开结扎线再灌注120 min，处死动物。livin组先开胸于lad结扎线上方注射livin载体50 μl(3.9×107/ml)，空载体组注射空载体50 μl,24 h后行ir过程。假手术组动物模型建立方法同上，在冠状动脉下穿线但不结扎。
1.3 实时荧光定量pcr检测
caspase3及livin mrna 按trizol 试剂盒提取鼠损伤区心肌组织总rna,以引物设计软件(oligo)六聚体为引物，以提取的总rna为模板，在amv催化下反转录出cdna。反转录体系如下：amv 酶1 μl，5×缓冲液6 μl，rnasin 1 μl，2.5 mmol/l 核苷酸dntps 2 μl，rna 5 μl，10 μmol /l随机引物1 μl，加depc处理水至总体积30 μl，42℃水浴1 h。各引物序列及扩增片段如下：livin： 上游 5′ atggggcctgagagtagggccag 3′，下游 5′ gacagaggccgaagctggcc 3′，169 bp;caspase3上游 5′ gtcgatgcagctaacctcag 3′，下游 5′ gacttagaatcacacacac 3′，156 bp;βactin：上游 5′ atggatgacgatatcgctgcg 3′，下游 5′ tccatatcgtcccagttggtg 3′，247 bp。实时荧光定量pcr根据试剂盒与扩增仪说明进行，每个标本扩增livin、caspase3基因同时都扩增βactin对照。
1.4 心肌梗死范围测定
再灌注结束时再次结扎lad，左室内注入2%伊文氏蓝2～3 ml，取出心脏，pbs冲洗，去除心房、右心室后低温(-80℃)保存。将冰冻后的心脏自心底向心尖垂直于心脏纵轴方向平均切成6片1 mm厚的环行切片，置于1% ttc的pbs 37℃孵育20 min。以湿重计算心肌缺血区(伊文氏蓝未染色而呈现砖红色)、梗死区(ttc 未染色而呈现苍白色)的重量。心肌梗死范围(%)=ttc未染区/伊文氏蓝未染区×100%。
1.5 tunel检测心肌细胞凋亡
实验结束后取出心脏，去除心房、右心室，4%多聚甲醛固定(4℃)，常规石蜡包埋，沿左室轴线横断面心尖上方4 mm每隔1 mm连续切取2张4 μm厚的切片。采用tunel法标记凋亡细胞核中的dna3′oh末端。实验同时加做不加tdt酶而其他条件相同的切片作为阴性对照。每一标本取3个不同部位的切片各一张，每张切片取10个视野，在400倍光镜下观察心肌细胞凋亡情况。计数每个视野tunel阳性细胞数和心肌细胞总数，以每视野阳性细胞数所占的百分比作为凋亡细胞指数(ai)，以10个视野的均值作为ai结果。
1.6 统计学处理
采用spss 10.0统计软件，计量资料以x±s表示，组间比较用t检验及单因素方差分析。
2 结 果
2.1 荧光定量pcr扩增结果
见表1。空载体组与ir组livin mrna与假手术组无差异，而livin组则高于假手术组和ir组(p<0.01)。livin组caspase3 mrna明显高于其他组，且空载体组及ir组也高于假手术组(p<0.01)。表1 各组心肌livin和caspaes3 mrna相对表达水平
2.2 心肌梗死范围测定结果
ir组心肌梗死范围为(22.91±1.97)%，livin组为(16.4±2.31)%，livin组较ir组明显缩小(p<0.05)。
2.3 心肌细胞凋亡
实验结果显示假手术组、空载体组、ir组、livin组细胞ai分别为1.43±0.71、17.2±0.56、16.35±4.40、4.70±1.49。ir过程中凋亡细胞数则明显增加， livin组心肌细胞凋亡明显减少，与ir组及假手术组比较均有差异(p<0.05)。
3 讨 论
研究已证实，糖尿病缺血型心脏病的产生与心肌细胞凋亡增加有关〔1～3〕。然而其机制仍不明确。caspase3是细胞凋亡调控的最后执行因子。本实验中可见ir过程中caspase3表达显著增加，表明其参与了ir，通过干预caspase3的表达，可以阻断细胞凋亡的进程。
iaps成员之一的livin可以特异的抑制caspase的活性，发挥抑制细胞凋亡的作用。livin含有杆状病毒iap重复序列(baculoviral inhibitor of apoptosis repeats，bir)和环锌指结构域(ring zinc finger domain，ring)，bir结构是结合和抑制caspase的关键部位，为livin抑制细胞凋亡的功能区域〔4～6〕，能够与caspase蛋白结合并有较强的抗凋亡功能。但是livin多分布在肿瘤组织，正常大鼠心肌仅有少量表达，转染外源性livin于大鼠心肌后可见局部livin高表达。
本研究发现livin在糖尿病大鼠心肌有表达，但呈低表达状态，给予外源性的livin注射于心肌内则可见较高表达。但是ir过程中caspase3的表达明显增多，应用表达livin的逆转录病毒载体干预后糖尿病大鼠心肌caspase3表达明显减少，表明表达livin的逆转录病毒载体在糖尿病大鼠心肌过表达后抑制了大鼠ir过程中caspase3的表达，转染表达livin的逆转录病毒抗体后心肌ir过程中细胞凋亡减少可能与此有关。
本实验结果提示表达livin的逆转录病毒载体有可能通过干预凋亡相关基因的表达，抑制心肌细胞凋亡，从而保护缺血心肌。转染表达livin的逆转录病毒载体，有望成为ir治疗的新途径。
【参考文献】
1 okoshi k，guimaraes jf，di muzio bp，et al.diabetic cardiomyopathy〔j〕. arq bras endocrinol metabol，2007;51(1):1607.
2 ghosh s.rodrigues b.cardiac cell death in early diabetes and its modulation by dietary fatty acids〔j〕.biochim biophys acta，2006;1761:114862.
3 chowdhry mf，vohra ha，galifianes m.diabetes increases apoptosis and necrosis in both ischemic and nonischemic human myocardium：role of caspases and polyadenosine diphosphateribose polymerase〔j〕.j thorac cardiovasc surg，2007;134(1)：12431.
4 chang h,schimmer ad.livin/melanoma inhibitor of apoptosis protein as a potential therapeutic target for the treatment of malignancy〔j〕.mol cancer ther,2007;6(1):2430.
5 murtaza i,wang hx,feng x,et al.downregulation of catalase and oxidative modification of protein kinase ck2 lead to the failure of apoptosis repressor with caspase recruitment domain to inhibit cardiomyocyte hypertrophy〔j〕.j bioil chem,2008;283(10):59966004.
6 zhu z,wang y,ding x,et al.expression and prognostic significance of livin in the progression of bladder cancer〔j〕.j huazhong univ sci technolog med sci，2008;28(1):902.
