【摘要】 目的 探讨肾综合征出血热(hfrs)患者外周血循环内皮细胞(cec)的数量变化及热休克蛋白70（hsp70）表达的意义。方法 54例hfrs患者按病情分为轻型20例，中型20例，重型及危重型14例，另取20例健康者作为对照。每例均按病期采血，采用percoll密度梯度离心法分离内皮细胞后，应用流式细胞技术检测cec数量及cec中hsp70的表达；分析不同病期、不同临床类型hfrs患者cec、hsp70变化的规律。结果 在不同病期的hfrs患者中，cec计数及hsp70的表达在发热期已升高，在低血压期和少尿期持续高水平，至多尿期及恢复期逐渐降低；在不同临床类型的hfrs患者中，随病情加重，cec数量及hsp70的表达亦相应增高，在重型和危重型患者中达到高峰。与健康对照组相比，不同病期、不同临床类型的hfrs患者cec数量及hsp70表达差异有统计学意义(p＜0.05)。结论 hfrs患者血cec数量和cec中hsp70表达均增高，其增高的程度与病期和临床类型有关。
【关键词】 肾综合征出血热 循环内皮细胞 热休克蛋白70
zhao xiuhua, zhang jingyao, jing yan, bian pengfei, wang chunxia, chen shijun
(jinan infectious disease hospital, jinan 250021, china)
to explore the significance of changes of circulation endothelial cells（cecs）and of the expression of heatshock protein70（hsp70） in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome(hfrs). method fiftyfour hfrs patients were assigned to the mild group(20 cases), the moderate group(20 cases) and the severe group(14 cases), and 20 healthy volunteers served as the controls. after cecs were separated by using the isopyknic centrifugation method, the cec number and hsp70 level were determined with flow cytometry. results the number of cec and the expression of hsp70 of hfrs patients began to increase in the fever stage and maintained a high level in the hypotension and oliguria stages, then gradually decreased in the diuretic phase and the recovery phase. in patients with different clinical types of hfrs, the cec number and the hsp70 level accordingly increased and reached the peak in severe and dangerous hfrs. in patients with different stages and types of hfrs, the number of cec and expression of hsp70 were both significantly higher than those of the controls. conclusion the cec number and expression of hsp70 both increase in hfrs patients and this is related to the stage and clinical type of hfrs.
key words： hemorrhage fever with renal syndrome; circular endothelial cells; heatshock protein 70
机体在受到病毒感染时，可出现自身保护性应激反应，选择性上调作为分子伴侣的热休克蛋白70(heatshock protein70，hsp70)的表达，对感染的细胞具有明显的保护作用。Www.133229.coM肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，hfrs)是由汉坦病毒（hantavirus，htv）引起的以发热、出血、低血压休克和肾功能衰竭为主要临床特征的急性传染病。目前，其发病机制尚未完全阐明。有学者认为，人血管内皮细 胞(vascular endothelial cell，vec)是htv感染的原始靶细胞，htv可直接导致全身毛细血管及小血管广泛损伤［1］。而循环内皮细胞（circulation endothelial cells，cec）是生理或病理情况下从循环中获得的脱落血管内皮细胞［2］，是目前惟一能够在活体持续检测到的可特异性、直接反映活体毛细血管损伤程度的指标。因此，本研究检测了54例hfrs患者不同病期、不同临床类型的cec的数量及cec中hsp70的表达，旨在了解不同病期、不同临床类型的hfrs患者cec数量及hsp70表达的意义。
1 材料与方法
1.1 病例来源 研究病例均为2006年1月～2007年12月在济南市传染病医院住院的hfrs患者，共54例，男45例，女9例，平均年龄为（40.19±17.39）岁。其中，轻型20例，中型20例，重型及危重型14例，所有患者血清hfrs特异性抗igm均阳性，诊断符合卫生部1997年颁布的流行性出血热防治方案中的临床诊断与分型标准。分次采集发热期、低血压休克期或少尿期，多尿或恢复期患者的抗凝血3ml，采血后6h内分离内皮细胞。对照组为20例健康查体者，男15例，女5例，平均年龄为（37.9±26.37）岁。两组间的年龄、性别均具有可比性。
1.2 材料 apccd31小鼠抗人单克隆抗体购自美国bioscience公司；fitchsp70小鼠抗人单克隆抗体购自stressgen 公司；内皮细胞分层液percoll原液、细胞固定破膜剂原液购自sigma公司；trucount管购自美国bd 公司；鞘液、hanks液由济南市传染病医院化验室提供。
1.3 方法
1.3.1 细胞分离 采用percoll密度梯度离心法分离出目的细胞，用大量hanks液清洗离心。
1.3.2 cd31抗体标记 在收获的细胞悬液内加apccd31小鼠抗人单克隆抗体避光孵育后用鞘液清洗、离心。apc小鼠igg1作为阴性对照。
1.3.3 细胞固定破膜 弃上清夜，在细胞悬液中加入固定破膜剂，避光反应后用鞘液清洗、离心。
1.3.4 hsp70抗体标记 弃上清夜，在细胞悬液内加fitchsp70，避光反应后用鞘液清洗、离心。fitc小鼠igg1作为阴性对照。
1.3.5 流式细胞仪检测 在bectondickinson facs cans上检测收获的细胞悬液。根据前向散射光及侧向散射光将目的细胞cec与血小板及细胞碎片分开，每例标本收集10000个细胞；根据阴性对照设定门，检测目的细胞群内cd31、hsp70双阳性细胞的百分比。
1.3.6 内皮细胞计数 在trucount管中加apccd31小鼠抗人单克隆抗体及充分混匀的抗凝全血，避光孵育后在trucount管中加溶血素，室温下避光孵育15min后用流式细胞仪检测。内皮细胞的数量根据以下公式计算:
细胞 (/μl) =获取细胞数×beads总量beads获取数×校本量
1.4 统计学处理 实验数据均以±s表示，采用spss13.0进行统计学处理。组间比较采用dunnett t检验及方差分析，p＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 不同临床类型hfrs患者cec的检测 见表1。发热期hfrs患者的cec值为(24.59±20.70)个/μl，与对照组的(3.29±1.51)个/μl相比，差异有统计学意义(p＜0.05)；轻、中、重及危重型hfrs患者发热期cec依次升高，分别为(18.03±4.84)、(26.03±4.31)、(62.30±6.49)个/μl，各型间差异均有统计学意义（p＜0.05）。
2.2 不同临床类型hfrs患者cec中hsp70的表达 见表3。发热期hfrs患者cec中hsp70阳性的细胞比率较对照组(27.15±6.40)明显升高(p＜0.05)。其中以重型hfrs患者hsp70阳性的细胞比率最高（62.99±11.31），其次为中型hfrs患者（52.64±4.80），轻型患者hsp70阳性的细胞比率最低（42.35±5.36），各型间差异均有统计学意义（p均＜0.05）
3 讨 论
早在1983年，kurata等［3］利用免疫荧光法检测到乳鼠毛细血管内皮细胞内有htv抗原的存在，提出内皮细胞可能是乳鼠htv感染的靶细胞。之后叶苓等［4］利用原位分子杂交研究hfrs尸检组织发现，htv易于感染上皮组织或血管内皮细胞。本研究结果显示，hfrs患者外周血cec的数量明显高于健康对照组，hfrs不同病期cec的计数不同，发热期最高，低血压休克期或少尿期仍维持较高水平，多尿或恢复期cec数量明显减少；不同临床类型的hfrs患者cec计数亦存在差异，以重型或危重型升高最明显，其次为中型，轻型患者的cec数量最低，但均明显高于健康对照组，各组间差异有统计学意义(p＜0.05)。导致上述结果发生的机制可能是：发热期（早期）htv在内皮细胞中大量复制，一方面入侵血管周围的基质细胞，影响内皮细胞的代谢功能，另一方面激活补体，加重内皮细胞损伤，致使内皮细胞与血细胞间的黏附能力下降，大量脱落进入血液循环系统，导致cec数量增高；病程晚期，随病毒损伤减弱，内皮细胞脱落减少，循环内皮细胞下降。上述结果进一步证实了毛细血管的内皮细胞是htv感染的主要靶点，并提示cec能较好地反映hfrs病情轻重，对判断预后和指导治疗有重要意义。
应激反应是生物体对于破坏细胞自身稳态的各种伤害性刺激进行反应的总和。若代偿反应不适当，就会破坏机体的生物稳态，导致细胞病变或机体损伤。有些体外实验证实，细胞在受到病毒感染后，可诱导hsp家族中不同成员的表达［56］。余璐等［7］报道，htv可诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞高表达hsp70。目前认为，hsp70是一种主要的伴侣蛋白，发挥“分子伴侣”作用，促进新生多肽链的正确折叠，协助新生蛋白质的合成和修复损伤的蛋白质，激活某些酶的作用以保护细胞的功能；而且还能通过阻断信号通路抑制应激诱导的jnk激活，减少细胞的凋亡，延长细胞的存活［8］。hfrs患者的内皮细胞能否发生应激反应、引起hsp70高度表达目前还没有明确的报道。为此，本研究检测了54例不同病期、不同临床类型的hfrs患者cec中hsp70阳性细胞的比率，结果显示，hfrs组hsp70的表达水平明显高于对照组（p＜0.05），且与疾病的临床类型密切相关，以重型hfrs患者hsp70阳性比率最高，次之为中型患者，轻型患者hsp70阳性比率最低，各型间差异均有统计学意义（p＜0.05）；在不同病期也具有类似的变化趋势，发热期hsp70的表达即明显升高，随病情加重，hsp70的表达相应增加，至多尿恢复期，hsp70的表达又逐渐减低，各组间差异有统计学意义(p＜0.05)。另外，检测结果还显示，随病情加重，至低血压休克期，hsp70的表达明显升高(p＜0.05 vs 发热期)，但cec数量无明显升高(p＞0.05 vs 发热期)；这说明人体在htv感染过程中自身的保护性应激机制增强，hsp70可能增强了血管内皮细胞对损害性刺激的耐受程度，维持了细胞的正常功能代谢，提高了细胞的存活率，从而使vec的脱落减少。患者在整个病期hsp70的表达均明显高于对照组，说明hsp70对病毒感染的应激反应持久，这可能对持续发挥其细胞保护作用非常重要。
总之，一方面，hfrs患者的cec中hsp70表达增高，可能对cec具有保护作用。另一方面，由于hsp具有很强的肽结合能力并参与抗原提呈的多个环节，若与htv的病毒蛋白相结合则有助于病毒蛋白的抗原提呈［9］，可刺激机体产生抗病毒的免疫应答。因此，在非应激情况下，选择性上调内皮细胞中hsp70的表达，可能有利于减轻内皮细胞的损伤，防止低血压休克、少尿的发生。
【参考文献】
［1］ geimonen e， lamonica r， springer k， et al. hantavirus pulmonary syndromeassociated hantaviruses contain conserved and functional itam signaling elements［j］. j virol, 2003, 77(2):16381643.
［2］ woywodt a, bahlmann f h, degroot k, et al. circulatin endothelial cells: life, death, detachment and repair of the endothelial cell layer［j］. nephrol dial transplant, 2002, 1(10):1728.
［3］ kurata t, tsai t f, bauer s p, et al. immunofluorescence studies of disseminated hantaan virus infection of sucklingmice［j］. infect immun, 1983, 41(1):391398.
［4］ 叶苓,杨守京,刘彦仿,等.流行性出血热尸检组织中hsp70mrna的定位及分布［j］.中国病毒学,1998,13(4):327331.
［5］ ohgitani e, kobayashi k, takeshita k, et al. biphasic transloacation of a 70 kda heat shock protein in human cytomegalovirusinfected cells［j］. j gen virol, 1999, 80(3):6368.
［6］ 赵君,杨守京,刘彦仿,等.实验性汉坦病毒感染乳鼠诱导脑神经细胞表达热休克蛋白70［j］.细胞与分子免疫学杂志,2000,16(3):232233.
［7］ 余璐，马恒，刘彦仿等.汉坦病毒诱导人脐静脉内皮细胞hsp70的表达及意义［j］.细胞与分子免疫学杂志， 2005,21(1):912.
［8］ latchman d s. heat shock proteins and cardiac protection［j］. cardiovasc res, 2001, 51(4):637646.
［9］ kumaraguru u, jr gouffon c a, 3rd ivey r a, et al. antigenic peptides complexed to phylogenically diverse hsp70s induce differential immune responses［j］. cell stress chaperones, 2003, 8(2):134143.
