【摘要】 目的 探讨非小细胞肺癌患者外周血树突状细胞亚群（dc1/dc2）和机体nk细胞含量之间的关系及其临床意义。方法 采用流式细胞术检测40例肺癌患者外周血dc亚群（cd11c+dc/dc1和 cd123+ dc／dc2）、nk细胞含量及血浆il12的浓度， 并以10例健康受试者作为对照。结果 肺癌患者外周血cd11c+dc百分率为（0.66±0.24）％，比对照组（1.38±0.18）％明显降低（p<0.01），cd123+ dc百分率（0.28±0.17）％与对照组（0.27±0.11）％相比， 差异无统计学意义（p＞0.05）；肺癌患者与健康人比较，nk细胞含量及il12的浓度均降低（p<0.05）。nsclc 患者nk细胞的含量与cd11c+百分数及血浆il12 浓度均呈正相关（p<0.05），与cd123+百分数呈负相关（p<0.01）。dc各亚型百分率同患者的卡氏评分、化疗史有关联（p<0.01），nk细胞的含量与年龄相关（p<0.05）。结论 非小细胞肺癌患者dc1功能低下，il12分泌能力障碍，从而影响了nk细胞的活性。dc亚型与nk细胞含量之间以及它们与临床生物学行为之间都有一定关系。
【关键词】 肺癌 树突状细胞亚群 自然杀伤细胞
树突状细胞（dendritic cell，dc）是一种专职的抗原提呈细胞， 依据 dc起源和功能，将人外周血 dc 分为两个亚群[14]。www.133229.CoM自然杀伤（nature killer，nk）细胞在机体免疫中地位重要，外周血nk细胞的变化是反映机体细胞免疫状态的重要指标[5]。晚期非小细胞肺癌患者dc亚群的表达水平如何，它同患者机体nk细胞的关系如何，以及此二者同步检测的临床意义究竟如何，目前尚无定论。本研究对40例晚期非小细胞肺癌患者的dc亚群和机体免疫状态进行了同步检测和分析，现总结报告如下。
1 资料与方法
1.1 病例选择
收集符合纳入标准的非小细胞肺癌患者40例，对照组10例，均为健康受试者。
1.1.1 纳入标准 （1）有明确病理诊断的iii～iv期非小细胞肺癌患者；（2）心、肝、肾和造血系统功能基本正常；（3）预计生存期在6个月以上；（4）karnofsky评分≥60分。
1.1.2 排除标准 （1）无明确病理诊断者；（2）预期生存期<6个月者；（3）合并有心、肝、肾和造血系统等严重疾病；（4）儿童、孕妇和精神病患者。
1.2 一般资料
按照上述条件共纳入40名患者，均为我科2006年8月～2006年12月期间的住院病人。其中男27例，女13例；年龄38～82岁，中位年龄63岁； iii期15例，iv期25例；病理类型：腺癌23例，鳞癌17例。
1.3 试剂与仪器
免疫荧光三标记 dc 检测试剂盒（3color dendritic value bundle）购自美国 becton dickson 公司，内有fitc标记的 lineage cocktail 1 （lin1），由cd3、cd14、cd16、cd19、cd20、cd56系列抗原混合单抗组成， cd11cpe、cd123（抗il3r）pe，抗hladrpercp及 阴 性 同 型 对照小鼠igg1pe/igg2pe；fitc或pe标记鼠抗人cd3-并cd16/cd56+单克隆抗体，facs calibur流式细胞仪（美国 becton dickson公司生产），离心机等。
1.4 测定指标与方法
1.4.1 外周血 dc1/dc2 亚型的检测 参考文献[6]，取肝素抗凝外周血500μl，分装4管， 每管100μl全血， 加入lin1、抗hladrpercp、cd123（抗il3r）pe、cd11cpe及阴性对照igg1pe/igg2pe单抗，振荡混匀，室温暗处反应15min，加入2ml溶血素，混匀、裂解10min，离心弃上清，洗涤1次，加入300μl的１％多聚甲醛溶液，用facs calibur流式细胞仪每管收集50000个细胞，fsc设阈值，排除碎片干扰，用cell quest 软件获取及分析hladr／lin1点图中的hladr阳性、lin 1弱阳性和阴性的细胞群体，以cd11c和cd123荧光抗体染色阳性细胞百分率记录结果。
1.4.2 nk细胞的检测 参考文献[7]，用fitc或pe标记鼠抗人cd3-并cd16/cd56+单克隆抗体，由流式细胞仪测定外周血中nk细胞含量。
1.4.3 血浆il12浓度检测 按照il12试剂盒的操作说明进行： 于96孔酶标板中每孔加入assay diluent rdif 50μl，各孔中分别加入已配制的il12标准液或已经室温融化并离心的血浆样本200μl，室温静置2h，弃上清液并用washer buffer洗涤3次，各孔中加入200μl il12结合物，室温静置2h，弃上清液并用washer buffer洗涤3次，加入200μ1底物溶液，室温避光静置20min，加入50μl终止液，静置25min后上酶标仪(450nm)读取od值，绘制标准曲线并求出各标本的血浆il12浓度。
1.5 统计学方法
应用spss13.0统计分析软件对实验数据进行统计，采用两样本均数差别的秩和检验、双变量相关分析及偏相关分析。
2 结果
2.1 外周血中树突状细胞亚型的检测
肺癌患者外周血髓系树突状细胞（mdc，cd11c+）的表达与正常对照组比较显著降低（p<0.01），淋巴系树突状细胞(ldc，cd123+)的表达与正常对照组比较差异无统计学意义（p>0.05），见图1、表1。表1 肺癌患者与健康对照组外周血树突状细胞亚型的检测结果
2.2 外周血中nk细胞活性及血浆il12浓度的检测
检测结果显示，nsclc 患者血浆il12 浓度为（3.19±0.30）pg/ml， 显著低于正常人（8.21±1.80）pg/ml (p=0.000)。nsclc患者与健康人比较，nk细胞的杀伤能力减弱，其含量为（15.51±2.15）％，低于健康对照组的（22.53±15.25）％（p=0.018），见图2、表2。
2.3 nsclc患者树突状细胞亚型、il12及nk细胞的含量之间相关性分析
对nsclc患者外周血中cd11c+、cd123+百
在fsc vs ssc散点图中划出单个核细胞区r1，然后将lin1表达阴性细胞设为r2（排除t、b、nk等细胞），再将hla-dr+cd11c+或hla-dr+cd123+设为r3（mdc或pdc）
图1 dc亚型流式细胞图
在fsc vs ssc散点图中划出淋巴细胞区r1，其中cd3-/cd16＋cd56+者即为nk细胞
图2 nk细胞流式细胞图
分数与il12、nk细胞的含量进行相关性分析，见表3。结果显示，nsclc 患者血浆il12 浓度同cd11c+百分数呈正相关（p<0.05）；nk细胞的含量与cd11c+百分数呈正相关（p<0.05），而与cd123+百分数呈负相关（p<0.01）。而nsclc 患者血浆il12 浓度同nk细胞的含量之间亦有关联性，即两者呈正相关（p<0.01）。表2 肺癌患者与健康对照组外周血中 nk细胞含量及t细胞亚群的检测结果表3 40例肺癌患者树突状细胞亚型与外周血il12、nk细胞含量之间的相关性表4 40例肺癌患者树突状细胞亚型与临床病理特征的关系
2.4 肺癌患者树突状细胞亚型、nk细胞含量与临床病理特征分析的关系
肺癌患者树突状细胞亚型、nk细胞含量与临床病理特征的关系，见表4。按照卡氏评分（<80vs≥80）、化疗史（有vs无）分组，cd11c+dc百分数有极其显著性差异（p<0.01），cd123+dc百分数有显著性差异（p<0.05）；按照病理类型（腺癌vs鳞癌）分组cd11c+dc百分数差异有统计学意义（p<0.05）；其余分组（性别、年龄、临床分期）之间的各dc亚型百分数比较差异均无统计学意义。而nk细胞的含量仅与年龄相关（p<0.05），同其他临床特征无明显关联（p>0.05）。
3 讨论
3.1 肺癌患者dc亚型的特征
树突状细胞（dc）是一种专职的抗原提呈细胞， 依据 dc起源和功能，将人外周血 dc 分为两个亚群：dc1亚群为髓样细胞来源（myeloid dc），它以 cd11c+dc 前体形式存在于外周血中，在炎症刺激时分化为成熟的 cd11c+ dc， 产生白细胞介素il12， 促进 th1 应答； dc2亚群为淋巴样细胞来源（lymphoid dc）， 由其 cd123+dc 前体细胞加 il3 诱导后分化为成熟的淋巴样 dc，不产生 il12，诱导 th2 应答。新鲜分离的外周血 dc 缺乏树枝状的形态学特征，其表面均弱表达或不表达单核细胞、淋巴细胞、嗜酸粒细胞、中性粒细胞及天然杀伤细胞的标记抗原， 但高表达hladr 抗原。因此，将 淋 巴 细 胞 系 列 抗 原 （lin1：cd3、cd14、cd16、cd19、cd20、cd56的混合体） 表达阴性或弱阳性，hladr表达阳性来初步界定dc群， 再根据 cd11c 和 cd123的表达来确定分别为 cd11c+dc/dc1和 cd123+ dc/dc2。
本次的实验结果表明：肺癌患者外周血cd11c+dc/dc1在白细胞中所占比例低于正常人（p=0.000），而cd123+ dc/dc2在白细胞中所占比例与正常人无显著差异（p=0.829），且cd11c+dc/dc1在数量上比cd123+ dc/dc2占优势，说明肺癌患者dc递呈抗原水平低于正常人，提示肺癌患者机体免疫功能受损，难以促使未成熟dc向mdc分化，不能有效地通过细胞免疫途径杀伤体内的肺癌细胞；而ldc无明显增多，即th2型反应无明显增强，说明体内针对肺癌细胞的体液免疫应答无明显增强。
3.2 肺癌患者dc亚型与nk细胞的关系
树突状细胞（dc）和自然杀伤（nk）细胞是自身免疫系统的两种独特成分，在免疫调节和适应性免疫反应的建立过程中起关键性作用。nk细胞主要通过细胞毒性效应以及产生细胞因子起作用，而dc则识别病原体并向适应性免疫系统发出警报。nk细胞是自体免疫系统中主要的淋巴细胞，通过其细胞因子产物溶解细胞，在免疫监视、免疫防御中起着十分重要的作用，具有体外杀伤肿瘤细胞的功能。
研究表明，dcnk细胞相互作用可导致细胞激活、成熟甚至死亡。fernandez等[8]的早期研究通过证明dc激活nk细胞抗肿瘤活性，首先证实了体内dcnk细胞的相互作用。体外研究表明，nk细胞和成熟dc的接触导致两种细胞的激活和细胞因子的产生，包括nk细胞增殖和dc成熟[911]。dc可以通过各种机制提高nk细胞的生存率，增加nk细胞活性和分化。其中重要的机制之一就是dc分泌的细胞因子，如il12。il12曾一度被称为自然杀伤细胞刺激因子或细胞毒性淋巴细胞分化因子，人体内的dc1可通过分泌il12，促进thl反应，诱导细胞免疫，而il12又可促进dc1的分化、成熟。事实上，人体内的dc能更好地支持nk细胞的存活[12]。成熟的dc还是il12的主要来源，il12可以增加nk细胞介导的细胞毒性和ifnγ产生[13]。
本研究结果显示nsclc患者外周血mdc含量及血浆il12降低，说明nsclc状态下外周血mdc存在il12分泌能力的障碍，从而影响了nk细胞的活性。提示nsclc患者体内不仅存在mdc数量的减少，而且存在nk细胞功能上的缺陷。nsclc患者体内dc产生和功能上的缺陷是肿瘤细胞逃脱机体监视的重要机制之一。另外，检测结果显示，随着cd123+ dc/dc2的百分含量下降，肺癌患者nk细胞含量增高（p=0.018），两者呈显著负相关。本试验证实，dcnk之间的相互作用和通讯，构成了一个正反馈环路，一旦2种细胞中的任何一种细胞感受到了“危险”或组织损伤发生，这一环路将被激活。dcnk细胞之间的相互作用是接触依赖型的，但也同时包括细胞因子之间的交互作用。
3.3 dc亚型与nk细胞之间关系分析的临床意义
由此可见，dc亚型分布情况、nk细胞含量在判断非小细胞肺癌患者病情发展上有一定的临床意义，它们同卡氏评分、是否化疗等临床特征之间均有十分密切的关系。所以，当肺癌发生时，宿主的dc亚群及nk细胞的功能低下、比例失调，导致机体免疫平衡失调。
随着肿瘤患者病情的发展，肿瘤某些生物学特征（机体免疫状态和其他一些生物学指标等）同时发生一些变化，进而提示这些指标之间有一定的相关性。本组研究表明，晚期非小细胞肺癌患者在接受化疗过程中，随着卡氏评分的逐渐降低，机体免疫功能逐渐下降，与此同时，dc各亚型的百分比也明显下降；提示肺癌患者外周血dc亚型与机体免疫状态之间有一种间接的相关性。
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