【摘要】 本研究探讨血小板糖蛋白特异性抗体在骨髓增生异常综合征（mds）患者发病中的作用。 采用改良的maipa法检测血浆血小板糖蛋白特异性抗体(抗gpⅱb/ⅲa抗体和抗gpⅰb/ⅸ抗体)。若患者的od值大于正常od值的均数+3倍标准差则为阳性。结果表明： mds组总阳性率为16.67%(5/30)， itp组总阳性率为46.67%(14/30)，两者之间差异有显著性（p<0.05）。结论： 部分mds患者的糖蛋白特异性抗体为阳性，这表明部分mds患者的血小板减少与免疫因素有关；血小板糖蛋白特异性抗体所致的血小板破坏在mds患者的血小板减少中可能具有一定作用，这为mds患者的免疫抑制剂治疗提供了新的依据。
【关键词】 骨髓增生异常综合征 血小板特异性抗体
expression of specific antibodies against platelet glycoproteins in patients with mds and its significance
wang juandong, pan xianglin, yin zhe, sun junhua, kong guixiang1, chen yingjie2, jiang cuiying2, dou aixia, wang zhilun
department of hematology, 1department of obstetrics, 2department of medical laboratory examination, the second hospital of shandong university, jinan 250033, china
abstract the aim of this study was to find platelet specific autoantibodies against glycoproteins in myelodysplastic syndrome (mds) and to explore its role in pathogenesis of mds. the plasma autoantibodies against gpⅱb/ⅲa and gpⅰb/ⅸ were measured by using a modified monoclonal antibody specific immobolization platelet antigens assay ( maipa). absorbance greater than mean value plus tripled standard deviation recorded from the normal controls were regarded as positive. the results indicated that the total positive rate in patients with mds was 16.67%(5/30), the total positive rate in patients with itp was 46.67%(14/30), the difference between mds group and itp group was significant (p<0.05). it is concluded that partial patients with mds have plasma specific autoantibodies against platelet gpⅱb/ⅲa and gpⅰb/ⅸ, indicating correlation of thrombocytopenia of patients with immune factors and the autoantibodymediated platelet destruction may be involved in the pathogenesis of mds. it provides a new basis for immunosuppression therapy for mds.
key words myelodysplastic syndrome; platelet specific antibody; glycoprotein
j exp hematol 2007; 15(1):95-98
骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome， mds）为造血干细胞的克隆性疾病。WWw.133229.CoM骨髓出现病态造血，外周血血细胞减少，其病因尚未完全明确。我们应用先进的改良maipa法（modified monoclonal antibody specific immobolization platelet antigens assay， maipa）检测mds患者血浆中血小板糖蛋白特异性抗体（抗gpⅱb/ⅲa抗体和抗gpⅰb/ⅸ抗体）的表达，以探讨mds患者血小板减少的可能机制及血小板糖蛋白特异性抗体在mds患者发病中的作用。
材料和方法
一般资料
骨髓增生异常综合征患者30例,其中男21例,女9例,年龄13-68岁,平均44.20±20.63岁。30例mds中mdsra 14例，mdsras 1例，mdsraeb 7例,mdsraebt 8例,全部符合骨髓增生异常综合征的诊断标准［1］。采血时全部患者的血小板均低于100×109/l，为（12-85）×109/l。特发性血小板减少性紫癜（itp）患者30例，男10例，女20例，年龄15-62岁，平均为30.18±17.07岁，全部符合itp的诊断标准［1］。采血时患者的血小板计数为 （14-61）×109/l。正常对照12例，为无输血史、无怀孕史的健康志愿者，男8例，女4 例，年龄20-52岁 ，平均为35.20 ±15.34岁，均取清晨空腹血2 ml， 5% edtana2抗凝。
单克隆抗体cd41a,克隆为hip8，特异性为抗血小板膜糖蛋白gpⅱb/ⅲa(becton dickinson公司产品)；单克隆抗体cd42b,克隆为sz2，特异性为抗血小板膜糖蛋白gpib/ⅸ和亲和纯化的羊抗鼠igg(h+l)（immunotech公司产品)；亲和纯化的碱性磷酸酶标记的羊抗人igg(fc特异性)（sigma公司产品）；蛋白酶抑制剂亮抑酶肽（leupeptin， acetylleuleuargal)(boehringer mannheim公司产品)。
血小板糖蛋白特异性抗体的检测
血浆的分离及保存 edta抗凝血2 ml离心后取上清，置－80℃保存。
多孔板抗体包被 准备包被液10 ml,抗体终浓度为3 μg/ml，加样,100 μl/well，塑料薄膜覆盖,4℃过夜，用0.01 mol/l pbs+tween 洗涤2次，每孔加入封闭液(0.01 mol/l pbs+tween+3% bsa)200 μl,置室温下30分钟，去除封闭液，控干，即用。
单克隆抗体俘获 制备单克隆抗体sz2或hip8稀释液(4 μg/ml)， 每孔加入50 μl 单克隆抗体稀释液，室温孵育60分钟(摇床)，用pbs+tween 洗板3次，待用于maipa。
改良maipa 取o型全血50 ml, edta抗凝，离心分离血小板，用pbs+edta洗涤2次，以2 ml pbs+edta重新悬浮血小板，调节血小板浓度至1×109/ml，移至ep管中,每管血小板1×108个， 每管加入100 μl待测血浆,在室温下孵育60分钟，pbs+edta 洗涤3次，然后用溶解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)110 μl溶解血小板,置于摇床上,4℃孵育30分钟,离心30分钟，取100 μl上清液以400 μl稀释缓冲液稀释，加样于羊抗鼠俘获单克隆抗体包被的96孔板上,设双复孔,每孔加入100 μl稀释上清，室温孵育60分钟(摇床)，0.01 mol/l pbs+tween洗涤4次，每孔加入100 μl碱性磷酸酶标记的羊抗人igg（1∶3 000），室温孵育60分钟(摇床)，0.01 mol/l pbs+tween洗涤6次，加100 μl pnpp/底物缓冲液,孵育15-60分钟,至显色，全自动酶标仪分别于405 nm、495 nm波长处观察结果，405 nm处od值减去495 nm处od值为患者的od值,取2复孔的平均值为测定值，每板设4个正常对照,若患者的od值大于正常od值的均数+3倍标准差则为阳性。
统计学处理
结果以阳性率表示。两个率的比较采用卡方检验。od值采用t检验。
结 果
各组血浆gp特异性抗体水平
抗gpⅱb/ⅲa od值： mds组为0.273±0.026； itp组为0.487±0.732； 正常对照组为： 0.264±0.013。抗gpⅰb/ⅸ od值： mds组为0.353±0.032； itp组为0.539±0.733； 正常对照组为： 0.319±0.024。抗gp od值mds组与正常对照组相比，p＜0.01，差异具有显著性； itp组与正常对照组相比，p＞0.05，无显著性差异（表1）。
血浆gp特异性抗体maipa法检测结果
血浆gp特异性抗体mds组中抗gpⅱb/ⅲa阳性者4例，抗gpib/ⅸ阳性者2例，双阳性者1例；itp组中抗gpⅱb/ⅲa阳性者10例，抗gpib/ⅸ阳性者7例，双阳性者3例；正常对照组阳性者为0（表2）。
抗gpⅱb/ⅲa特异性抗体阳性率 mds组为13.33%(4/30)， itp组为33.33%(10/30)，两组比较： χ2=3.35，p>0.05，差异无显著性。与正常对照组比较：mds组p>0.05，差异无显著性；itp组p＜0.05，有显著性差异（表2）。
抗gpⅰb/ⅸ特异性抗体阳性率 mds组为6.67%(2/30)，itp组为23.33%(7/30)，两组比较： χ2 =2.09，p>0.05，差异无显著性。与正常对照组比较：mds组和itp组p值均大于0.05，无显著性差异（表2）。
总阳性率 mds组为16.67%(5/30)，itp组为46.67%(14/30)，两组比较： χ2 =6.239，p<0.05，两组之间有显著性差异。与正常对照组比较：mds组p>0.05，差异无显著性；itp组p＜0.05，有显著性差异。（表2）。
抗gp特异性抗体阳性率 mdsra 14例阳性率为21.43%（3/14），mdsras 1例阳性率为0，mdsraeb 7例阳性率为14.29%（1/7）,mdsraebt 8例阳性率为12.50%（1/8）。mdsra阳性率高于其余各组，但差异无显著性。
讨 论
在巨核细胞和血小板表面存在着大量的糖蛋白(gp)，其中最重要的是gpⅱb/ⅲa、gpib/ⅸ。这些gp分子不仅是血小板发挥功能所必需的成分，而且可以作为血小板自身抗体的靶抗原。改良maipa法对免疫性血小板减少的的诊断具有极高的特异性,可达95%，对血浆gpⅱb/ⅲa和gpib/ⅸ抗体检测的敏感性达40%［2］。
近年来的研究表明，部分mds患者存在自身抗体和单克隆免疫球蛋白病，表现为多种免疫球蛋白水平升高和多种自身抗体的产生［3，4］，提示部分mds患者存在体液免疫方面的异常。mds的血小板减少的原因通常认为是中枢性的，而bourgeois等［5］对61例血小板减少的mds患者的血小板寿命进行了观察，结果发现15%（9/61）的患者血小板寿命缩短＜3.5天，对其中6例病人行脾脏切除术，术后患者血小板均增高。这些结果提示，在某些病例可能同时有外周血血小板降低是由血小板破坏造成的，那么，外周血小板的破坏是否有免疫因素参与、与血小板gp特异性自身抗体是否有关，目前国内有关这方面的研究较少。
为了明确血小板gp特异性自身抗体是否与mds患者的血小板减少有关。我们应用先进的改良maipa法检测了30例mds患者血浆中血小板gp特异性自身抗体（抗gpⅱb/ⅲa抗体和gpib/ⅸ抗体）的表达。结果显示，部分mds患者血浆中血小板gp特异性抗体为阳性，提示部分mds患者的血小板减少与免疫因素有关, 是由血小板gp特异性抗体所致的血小板破坏造成的。这种破坏可能通过血小板gp特异性自身抗体与血小板膜表面糖蛋白结合完成的，一方面被抗体包被的血小板可通过巨噬细胞上的fc受体与巨噬细胞相连，被巨噬细胞吞噬；另一方面抗原抗体复合物可激活补体，直接破坏血小板，或通过c3b与巨噬细胞上的c3b 受体结合，使血小板破坏增多。另外，巨核细胞表面亦表达gpⅱb/ⅲa和gpib［6］，自身抗体与巨核细胞上相应的抗原结合，可干扰巨核细胞的增生、成熟和血小板的产生，或在骨髓内血小板即被活化的补体或巨噬细胞破坏，结果不仅使血小板破坏增加，而且使血小板生成减少［7］。这为mds的免疫抑制剂治疗提供了新的依据。
本实验结果显示，mds组与itp组抗gp特异性抗体总阳性率的比较有显著性差异，提示改良maipa法检测患者血浆中血小板gp特异性抗体的表达有助于鉴别免疫性血小板减少和非免疫性血小板减少。
本实验检测到的mds患者血浆中血小板gp特异性抗体的阳性率较低，可能因为： ①血小板的免疫性破坏仅是引起mds患者血小板减少的原因之一，mds的发病原因目前尚不完全清楚，多种因素可能同时参与了疾病的发生； ②免疫抑制剂治疗后自身抗体的滴度降低。本研究中部分mds患者是是既往曾用过或正在使用免疫抑制剂治疗； ③仅检测了抗gpⅱb/ⅲa和gpib/ⅸ特异性自身抗体，可能这两项抗体均为阴性的患者中含有其他自身抗体，如抗gpia/iia、gpiv、 gpv、 gmp140、膜骨架蛋白等特异性自身抗体； ④仅检测了igg 型自身抗体。少数患者抗体可能为iga型或igm型。
另外，抗gp特异性抗体mdsra 阳性率高于其余各组，但差异无显著性，此结果提示免疫因素在mds的各型发病中所起的作用可能有所不同，尚需进一步研究。
致谢 感谢山东大学齐鲁医院侯明教授及朱媛媛老师的支持与帮助！
【参考文献】
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