【摘要】 目的 探讨沙眼衣原体(CT)所致新生儿结膜炎的流行病学情况。方法 采用细胞培养和PCR两种方法检测1997年10月～1998年9月重庆医科大学附属儿童医院125例新生儿结膜炎患儿的结膜标本中的CT。结果 CT 感染阳性率为51.2%(64/125)，经阴道分娩儿CT感染率(74%，60/81)明显高于剖宫产儿(9%，4/44)(χ2 = 48.20，P< 0.01);细胞培养和PCR对结膜标本CT的检出率分别为41.6%(52/125)和48.8%(61/125)，敏感性分别为81.3%和94.2%，二者差异有显著性(χ2 =70.47，P<0.05)。 结论 该组新生儿结膜炎的最主要病原菌是CT;新生儿CT感染与分娩方式有一定的关系，产道是新生儿获得CT感染的主要途径。但是，宫内CT感染也可引起新生儿结膜炎。对CT的检测， PCR的敏感性高于细胞培养。
【关键词】 衣原体，沙眼; 婴儿，新生; 结膜炎，细菌性; 细胞，培养的; 聚合酶链反应
Conjunctivitis caused by Chlamydia trachomatis in neonates
YANG Jun, WEI Hong, WU Shixiao, et al.
Reasearch Insititute of Pediatrics,Chongqing Medical University, Chongqing 400014, China
【Abstract】 Objective To investigate the prevalence of neonatal conjunctivitis caused by Chlamydia trachomatis and to evaluate two methods of detecting Chlamydia(C.) trachomatis in neonatal conjunctival specimens. Methods A total of 125 conjunctival scrapings taken from neonates with conjunctivitis in Children′s Hospital during October 1997-September 1998 was tested by the McCoy cell culture and polymerase chain reaction (PCR). Results The detection rates of C. trachomatis in neonatal conjunctivitis were 41.6% by cell culture and 51.2% by PCR, respectively. The sensitivities of cell culture and PCR were 81.3% and 94.2%, respectively. The prevalence of C. trachomatis conjunctivitis was obviously higher in neonates delivered through vagina than those by cesarean section delivery (74% and 9%, respectively, P<0.01). Conclusion C. trachomatis was the main pathogenic microorganism of neonatal conjunctivitis in Children′s Hospital during the year 1997 to 1998 (51.2%). The C. trachomatis infection in neonates related to the delivery mode, espevially the passage through the birth canal, but sometimes may be caused by the intrauterine infection. PCR showed more sensitive than the cell culture in the detection of C. trachomatis.
【Key words】 Chlamydia trachomatis; Infant, newborn; Conjunctivitis, bacterial; Cells, cultured; Polymerase chain reaction
新生儿结膜炎是新生儿最常见的眼炎，传统的诊断、治疗和预防新生儿结膜炎主要是针对淋球菌、葡萄球菌、链球菌等。近年来，在发达国家及一些发展中国家本病病原发生了很大变化。沙眼衣原体(chlamydia trachomatis,CT)已成为新生儿结膜炎的最主要病原菌，其发生率高达10～63/1 000个活产儿[1]，而淋菌性新生儿结膜炎已很少见，发生率仅0.04%。我院于1997年10月～1998年9月对125例新生儿结膜炎进行了病原研究，以探讨CT结膜炎的发病情况。
对象和方法
一、对象
选自1997年10月～1998年9月在我院就诊的新生儿结膜炎(结膜充血，眼部有分泌物)患儿125例，男69例，女56例;日龄3～21 d;早产儿24例，足月儿95例，过期产儿6例，胎龄31～ 44周，平均胎龄37.4周; 体重< 2 500 g 46例，≥2 500 g 79例，平均体重(2 770±360) g。取下睑结膜刮片标本，均做小鼠细胞(McCoy细胞)培养及PCR，以检测是否为CT感染。
二 、细胞培养
按美国疾病控制中心(CDC)推荐的方法采样、转运及培养[2]。
1. 细胞株：McCoy细胞株。
2. 方法：用自制小刮片高压灭菌后刮取患儿下睑结膜上皮细胞，置入转运培养基(含蔗糖，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾)中，放入4 ℃ 冰壶内立即送至实验室，8 h内接种或贮存于-70℃冰箱中，以后接种于制备好的单层McCoy细胞。于35℃将已接种的培养物离心1 h，离心速度3 000 r/min。加入1 ml含有放线菌酮(3.5 μg/L)的培养基，于35℃ 5% CO2 条件下孵育48～72 h。盲传二代。碘染色后在光学显微镜下，以低倍镜观察被染细胞有无棕色包涵体。用高倍镜确认包涵体，了解是否在细胞浆内以及是否具备CT的特征。
三、聚合酶链反应(PCR)
采用CT特异的主要外膜蛋白基因序列引物，引物系位于外膜蛋白基因第4可变区(VS4)相邻稳定区内的2条23个碱基对(bp)的寡核苷酸，其序列如下：CT 1：5′-GGCAAGCAAGTTTAGCTCTCTCT-3′， CT 2：5′-GTTCCTACTGCAATACCGCAAGA-3′，扩增所获得的目的片段277 bps[3]。紫外灯下观察，出现预计分子量大小的DNA条带(277 bp)为阳性。
四、统计学处理方法
四格表变量采用χ2 检验。
结 果
一、 检测结果
125 例眼结膜上皮刮片标本中，细胞培养 CT阳性感染率为41.6%(52/125)， PCR CT 的阳性率为48.8% (61/125);敏感性分别为 81.3%和94.2%，二者相比，差异有显著性意义(χ2=70.47，P<0.05)。本资料中，CT细胞培养与 PCR均阳性 49例，细胞培养阳性而 PCR阴性3例，细胞培养阴性而 PCR阳性 12例，所以，CT感染引起的新生儿结膜炎应为64例，由 CT感染引起的新生儿结膜炎的发生率为 51.2%(64/125)。
二、64例CT新生儿结膜炎临床资料
1.发病时间：最早1例在生后第 3天即可检出 CT，而62例在生后第7～14天检出 CT，1例在生后第21天检出 CT。
2.分娩方式：125例结膜炎患儿中81例为经阴道分娩，44例为剖宫产;在 CT感染的 64例患儿中，60例是经阴道分娩，4例为剖宫产，无一例有胎膜早破。阴道产儿 CT感染率74% (60/81)，与剖宫产儿感染率9%(4/44)相比，差异有非常显著性(χ2 =48.20，P<0.01)(表1)。分娩方式与CT感染密切相关，产道是新生儿感染的主要途径。4例剖宫产儿均无胎膜早破，而CT阳性，提示患儿CT感染是由宫内感染引起。
表1 分娩方式与CT感染的关系(例数)
分娩方式 CT(阳性) CT(阴性) 合计
阴道产 60 21 81
剖宫产 4 40 44
合 计 64 61 125
χ2值 48.20
P值 <0.01
3.临床表现：64例CT结膜炎新生儿均无发热，临床表现无特异性。50例双侧结膜受累，表现为双侧程度不一的结膜充血，下睑结膜水肿，未见到滤泡形成。26例为粘液性分泌物，30例为脓性分泌物。14例仅单侧受累，故单从临床症状难以进行病原学诊断。
讨 论
CT是一种革兰阴性细菌，缺少合成高能物质(如ATP)的酶系统，宿主细胞主要是上皮细胞。作为泌尿生殖道的常见病原，我国近年来对CT感染的调查表明，正常人群宫颈CT感染率为1.0%～2.4%[4]，孕妇宫颈CT感染率为9.1%～23.7%[ 5～7]，在高危人群中，CT感染率达20.5%～50.8%[8,9]。 而作为感染人群中的特殊群体，在美国，妊娠期妇女感染率达到2%～47%[10]，其所生新生儿23%～70%可被CT感染，25%～50%有暴露的新生儿可发展成结膜炎[11]。我们曾对278例产前孕妇取宫颈标本549份，取79例随访婴儿鼻咽拭子及眼结膜标本均做细胞培养及PCR检测CT，母婴垂直传播率为55.0%，其所生新生儿27.3%发生CT结膜炎[12]。国外报道，对于新生儿结膜炎的病原，CT居于首位，占10%～74% 远远高于淋球菌。本资料中，CT感染和新生儿结膜炎的发病密切相关，64例结膜炎患儿结膜刮片标本检出 CT，占所有样本的51.2%。提示本地区，CT是新生儿结膜炎的最主要病原菌。并且，我院近年来131例新生儿结膜炎分泌物普通培养以表皮葡萄球菌为最多(27.5%)。其他依次为大肠杆菌(16.0%)、腐生葡萄球菌(16.0%)、肺炎克雷伯菌(9.7%)、金黄色葡萄球菌(9.1%)、绿脓杆菌(7.6%)、甲型溶血性链球菌(3.0%)、其它细菌12.2%，无一例为淋球菌。
本资料提示，分娩方式和CT感染密切相关，阴道产新生儿比剖宫产新生儿更容易感染CT，新生儿CT感染主要是在生产过程中通过被CT感染的产道时所获得。剖宫产感染常先有胎膜早破，上行感染。但胎膜未破的剖宫产儿被CT感染较少见，Pao等[13]报道9例孕妇宫颈细胞PCR检测CT阳性，其中2例羊水中也有CT DNA，均无胎膜早破。有1例胎膜未破剖宫产早产儿生后2 d死亡，经肺组织培养证实死于CT肺炎[11]。Shariat等[10]也报告1例胎膜未破的剖宫产足月儿，生后3 d发生CT结膜炎。本资料中4例剖宫产患儿无一例有胎膜早破，可能是CT经宫颈上行进入羊膜腔引起宫内感染所致。
CT D-K 、Da、Ia 10个血清型引起新生儿结膜炎，一般是在生后第5～14天发病，患儿不发热，常以粘液性分泌物症状起始，很快发展成脓性，以下睑结膜为主，眼睑常水肿，结膜明显充血。临床上很难与其他病原菌引起的结膜炎鉴别，必须依靠实验室检测方能确定病原。
对于CT的病原学检测，经典的方法是分离病原。随着分子生物学的进展，用简单、快速、准确、实用的分子生物学技术对CT进行检测是目前发展的趋势。我们采用细胞培养和PCR检测CT，作为传统的检测诊断CT的金标准，细胞培养虽然特异性高达100%，但是由于不能检出已死亡的CT，故其敏感性并非100%。PCR检测CT非常敏感和特异，PCR的高度敏感性可以检测出细胞培养阴性标本中死亡的CT，也符合其他文献报道[14]。PCR检测CT，可扩增3种目的DNA：(1)CT共有质粒;(2)CT 16s RNA;(3) ompl。需注意测试手段的特异性，通常应有效地设置阳性和阴性对照，防止空气中操作器械及操作人员外源DNA污染[15]。实验中使用一次性吸头，严格无菌操作，以确保无外源DNA污染，每次检测均设置阳性对照及阴性对照，以避免出现假阴性及假阳性结果。
(本文编辑：徐福兰)
作者单位：杨军(400014 重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所)
韦红(400014 重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所)
吴仕孝(400014 重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所)
刘官信(400014 重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所)
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