关键词:牛磺酸；视网膜光化学损伤；凋亡细胞；c
摘要：目的观察饲料中添加牛磺酸对光化学损伤后大鼠光感受器细胞凋亡的影响，并进一步从氧化应激基因cfos表达变化角度探讨其防护机制。方法70只sd大鼠随机分为对照组、牛磺酸组。分别喂饲标准饲料或添加4％牛磺酸饲料喂饲15d后接受(3000±200)lx持续0，1，3，6，9，12,24h光照，凋亡细胞原位末端标记法(tunel)检测光感受器细胞凋亡情况并计算凋亡指数(ai)；rtpcr法及免疫印迹法检测视网膜内cfosmrna以及蛋白表达水平。结果感光细胞凋亡指数随光照时间延长逐渐增加，牛磺酸组ai显著低于对照组(p<005)，其中光照12h牛磺酸组与对照组ai分别为(123±47)％和(324±62)％；视网膜cfosmrna光照1h后一过性表达增高，牛磺酸组较对照组低(p<005)；光照后视网膜cfos蛋白表达逐渐升高，于3h达峰值，牛磺酸组显著低于对照组(p<005)。结论在视网膜光化学损伤条件下，牛磺酸可能通过抑制视网膜cfos的转录及表达，阻断光感受器细胞凋亡转导从而保护视网膜。
关键词：牛磺酸；视网膜光化学损伤；凋亡细胞；cfos
effectsoftaurineoncfosexpressionofratretinaafterphotochemicaldamage
chenka,mimantian,yuxiaoping,etal.
departmentofpreventivemedicine,thethirdmilitarymedicaluniversity(chongqing400038,china)
abstract：objectivetoobservetheeffectofdietarysupplementationwithtaurineonphotoreceptorapoptosisandfurtherinvestigatechangesofcfosexpressionofratretinaafterphotochemicaldamage.methodsseventyratswererandomlydividedintocontrolgroup(control)and4%taurinesupplementationgroup(taurine).thesubjectswereexposedto(3000±200)lxtransmittedbysixcoldwhitelightsfor0,1,3,6,9,12,24h.theapoptoticphotoreceptorcellsweredetectedusingtunelmethod;totalrnaandproteinofretinawereextracted;relativecfosmrnalevelsweredeterminedusingrt-pcrandcfosproteinlevelsweredetectedbywestern-blotanalysis.resultswiththelightexposuretimeprolonged,apoptosisindex(ai)ofphotoreceptorcellswaselevated,amongwhichtheaiof12hwere(12.3±4.7)%and(32.4±6.2)%intaurineandcontrolgroup(p<0.05).thecfosmrnaofratretinawastransientlyinducedafterone-hourlightexposureanditwaslowerintaurinegroup(p<0.05);cfosproteinlevelincreasedafterthreehourexposureanditwaslowerintaurinegroup(p<0.05).conclusiontaurinecanpartlyreducethetranscriptionandtranslationofc-fos,whichwouldfurtherinhibittheapoptosissignaltransductionandprotecttheratretinafromphotochemicaldamage.
keywords：taurine;photochemicaldamage;apoptoticcell;cfos
视网膜是视觉形成的重要组织结构，若光照时间或光照强度等超过视网膜承受力，则会导致光化学损伤〔1〕，损伤早期视功能减退，光感受器细胞丢失，后期内层神经元变性坏死，最终导致失明〔12〕。www.11665.cOm近年研究认为，凋亡是视网膜光化学损伤中光感受器细胞丢失的主要机制〔1,3〕，持续高强度光照使视网膜内自由基和脂质过氧化产物激增，同时氧化应激基因ap1表达上调促进凋亡信号转导，且证实其亚单位cfos是必需调控因子。牛磺酸与视网膜生长发育和功能维持关系密切，前期实验已证实，4％牛磺酸能有效保护光化学损伤条件下的大鼠视网膜〔4〕。本研究拟进一步观察其对光感受器细胞凋亡的影响，并从cfos表达变化角度探讨防护机制。
1材料与方法
11实验动物及分组清洁级sd大鼠(第三军医大学第三附属医院动物中心)70只，体重150g左右，雌雄各半。随机分为对照组、牛磺酸组，分别喂饲标准饲料或添加4％牛磺酸(北京世纪维他生物技术有限公司，纯品)饲料15d后，各组5只大鼠分别接受(3000±200)lx持续0，1，3，6，9，12，24h光照。
12凋亡细胞的原位末端标记法(tunel)检测光感受器细胞凋亡情况大鼠光照后立即取出眼球，4％多聚甲醛固定过夜，常规石蜡切片，tunel试剂盒(德国roche公司)检测视网膜光感受器细胞凋亡情况参照试剂说明书，计数10个油镜视野下每张切片tunel阳性细胞数，其与光感受器细胞总数比值为光感受器细胞凋亡指数(ai)。
13视网膜总rna提取及rtpcr大鼠光照后立即取出眼球，解剖显微镜下小心剥离视网膜，参考trizol试剂说明书常规提取总rna，核酸蛋白检测仪测定其含量与纯度。-20℃保存备用。rtpcr按照逆转录试剂盒说明书进行，以大鼠βactin为内参，上游引物序列为5′gacccagatcatgtttgagacc-3′，下游引物序列为5′gccaggatagagccaccaat-3′，退火温度为554℃，产物长度为684bp；cfos上游引物序列为5′gcctttcctactaccattcc-3′，下游引物序列为5′atcttattcctttcccttcg-3′，退火温度为533℃，产物长度为370bp。扩增条件为94℃5min40s，各退火温度45s，循环32次，72℃10min。2％琼脂糖凝胶电泳，bio-rad凝胶成像分析系统扫描以及分析。pcr特异条带以相对吸光度×面积(mm2)表示，
以各组的校正吸光度与其βactin校正吸光度的比值表示(v)。
14免疫印迹法测定视网膜cfos蛋白表达情况大鼠光照后立即取出眼球，剥离视网膜，常规方法提取总蛋白，lowry法定量。总蛋白(40μg)经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sdspage)(5％积层胶、12％分离胶)后，采用biorad半干转印仪将凝胶中的蛋白转印至聚偏二氟乙烯(pvdf)膜，利用cfos多克隆抗体(1：150稀释，北京中杉生物制剂公司)检测膜上蛋白。biorad凝胶成像分析系统分析相对表达量，以0h组蛋白表达量为内参，其他各个时相点灰度值与内参比值为相对灰度值(a)。
15统计分析采用spss100统计软件进行方差分析。
2结果
21牛磺酸对光照后大鼠视网膜光感受器细胞凋亡的影响对照组光照6h后，发现棕褐色tunel阳性细胞散在分布于外核层(onl)内部，即受损的多为视杆细胞，而牛磺酸组光照9h后才开始出现阳性细胞，随光照时间延长，阳性感光细胞增多，光照24h后视网膜内核层、节细胞层也出现大量阳性细胞(图1)。光化学损伤后ai随光照时间延长逐渐增高，牛磺酸组光照12hai值(123±47)％显著低于对照组(324±62)％，其他时相点也显著低于对照组(p<005)。
a：对照组，光照0h；b：对照组，光照9h；c：牛磺酸组，光照9h
图1牛磺酸对光化学损伤后大鼠视网膜光感受器凋亡的影响(tunel，×400)（略）
22牛磺酸对光照后大鼠视网膜cfos转录以及表达的影响
221牛磺酸对光照后大鼠视网膜cfosmrna表达的影响光照后对照组和牛磺酸组大鼠视网膜cfosmrna表达均出现一过性增高，且在光照1h达到峰值，随着光照时间延长其表达逐渐降低，于6h光照后其表达量接近未光照水平(图2)。利用灰度扫描计算v值发现，光照1h时牛磺酸组大鼠视网膜cfosmrna较对照组表达低(p<005)。
222牛磺酸对光照后大鼠视网膜cfos蛋白表达的影响光照后2组动物视网膜cfos蛋白表达逐渐增高，于光照3h达到峰值，随光照时间延长其表达量逐渐降低，光照12h其表达量接近未光照时水平(图3)。a分析提示牛磺酸组3h蛋白表达相对量比对照组低(p<005)。
d：对照组；t：牛磺酸组
图2不同光照时间对大鼠视网膜cfosmrna表达的影响（略）
d：对照组；t：牛磺酸组
图3不同光照时间对大鼠视网膜中cfos蛋白表达的影响（略）
3讨论
视网膜光化学损伤后光感受器细胞丢失的机制尚存在一定的争议，但大部分研究者认为，凋亡是光化学损伤以及其他视网膜变性疾病光感受器细胞丢失的主要机制〔3，5〕。本研究在前阶段证实，4%牛磺酸能有效保护持续高强度光照〔(3000±20)lx，24h〕条件下大鼠视网膜基础上，结合凋亡细胞生化特征，采用tunel法检测凋亡细胞。实验结果提示，牛磺酸减少了光照不同时相点凋亡指数，与其他研究报道〔6，7〕牛磺酸具有抗神经元凋亡作用相符。近年研究发现，ap1是调控光感受器细胞凋亡的重要影响因子，其亚基cfos是必需的调控因子〔3，8〕。ap1参与了许多生理过程如细胞增殖、分化、死亡及恶性转化等，脂多糖、氧化应激、紫外线等均能增加其活性，并通过调节靶基因转录发挥作用〔7〕，其中，cjun／cfos二聚体形式的ap1复合物生物活性最强〔6〕。光损伤条件下cfos(-／-)大鼠光感受器细胞几乎未丢失，以及大鼠、小鼠和661w光感受器细胞短期光照后cfosmrna表达一过性增高，均说明cfos在光诱导光感受器细胞凋亡中促进凋亡作用〔3，8〕。本研究发现,牛磺酸组cfosmrna以及蛋白表达峰值均比对照组低，推测牛磺酸可能通过抑制cfos表达，导致整个ap1复合物减少，阻断凋亡信号转导，从而有效保护光感受器细胞。文献报道，taucl能降低fls细胞ap1活性，而牛磺酸不能〔9〕。因此，牛磺酸可能通过捕捉次氯酸(hoci)形成tauc1，taucl才是牛磺酸的活性形式，上述推论还需进一步证实。
参考文献
〔1〕刘辉，金玉兰.牛磺酸研究的进展［j］.国外医学妇幼保健分册，2002，13(1)：40-41.
〔2〕张剑利，苏小枚，毕力夫，等.牛磺酸对小鼠视网膜光损伤保护作用的实验研究［j］.山西医科大学学报，2002，34(2)：113-115.
〔3〕wenzela,grimmc,martia,etal.cfoscontrolsthe“privatepathway”oflight-inducedapoptosisofretinalphotoreceptors［j］.neurosci,2000,20(1):81-88.
〔4〕ildikókáldi,martinre,huangh,etal.brightcyclicrearingprotectsalbinomouseretinaagainstacutelight-inducedapoptosis［j］.molecularvision,2003,9:337-334.
〔5〕hafezif,martia,grimmc,etal.differentialdnabindingactivitiesofthetranscriptionfactorsap-1andoct-1duringlight-inducedapoptosisofphotoreceptors［j］.visres,1999,39(15):2511-2518.
〔6〕周咏东，严密，张军军，等.可见光对培养的人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响［j］.中华眼底病杂志，2002，18(3)：227-230.
〔7〕fleischmanna,hafezif,elliottc,etal.fra-1replacesc-fos-dependentfunctionsinmice［j］.genesdev,2000,14(21):2695-2700.
〔8〕hafezif,steinbachjp,martia,etal.theabsenceofcfosprevent
slight-inducedapoptoticcelldeathofphotoreceptorsinretinaldegenerationinvivo［j］.natmed,1997,3(3):346-349.
〔9〕kontnye,szczepanskak,kowalczewskij,etal.themechanismoftaurinechloramineinhibitionofcytokin(interleukin-6,interleukin-8)productionbyrheumatoidarthritisfibroblat-likesynoviocytes［j］.arthritisrheum,2000,43(10):2169-2177.
(文涛编辑郑新校对)
*基金项目：国家自然科学基金(30200228)
作者单位：第三军医大学预防医学院营养与食品卫生学教研室，重庆400038
