摘 要：目的：探讨外源性雌激素对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用。方法：取72只雄性SD大鼠随机分为正常组，缺血再灌注组（IR），苯甲酸雌二醇处理组（E2+IR）。其中后两组又分为再灌注后6 h、24 h、48 h，72 h组（每组8只）。对视网膜进行常规HE染色光镜下观察视网膜组织形态变化，用免疫组织化学方法检测视网膜组织中caspase-3的表达变化，采用DNA原位末端标记（TUNEL）法检测视网膜组织中的调亡细胞。结果：苯甲酸雌二醇处理组视网膜组织形态变化趋势与单纯缺血再灌注组相似，但组织损伤程度明显改善。caspase-3蛋白的表达在各时间点上较单纯再灌注组明显下调（P＜0.01）。结论：苯甲酸雌二醇可下调caspase-3蛋白的表达，抑制细胞调亡，保护视网膜组织。
关键词：雌二醇；缺血再灌注；细胞凋亡；caspase-3；大鼠
视网膜缺血再灌注损伤（Retina ischemia-reperfusion injury，RIRI）是目前一种临床常见眼病，患者在缺血再通后，视力反而进一步恶化。所以，增强对RIRI损伤机制及保护作用的研究是具有重要现实意义的。有研究证明雌激素对脑、肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用。因此雌激素在眼科中的应用也引起了广泛的关注。
1 资料与方法
1.1 一般资料：雄性SD大鼠72只（辽宁医学院实验动物中心提供），体重170～250 g，随机分3组：正常组（8只），单纯缺血再灌注组（IR，32只），苯甲酸雌二醇处理组（E2+IR，32只）。后两组又分为再灌注6 h，24 h，48 h，72 h，每组8只。
1.2 实验动物模型制备：正常组，不做任何处理；IR组只通过升压装置提高前房眼压制备缺血再灌注模型；（E2+IR）处理组于再灌注前7 d，按200 μg/kg大鼠体重的剂量肌内注射苯甲酸雌二醇注射液，1次/d。后与IR组同时提高眼压制备缺血再灌注模型。
1.3 取材：分别于再灌注后6 h，24 h，48 h，72 h时间点取各组造模大鼠8只，正常大鼠1只，40 ml/L多聚甲醛溶液灌流处死。取眼球经固定、脱水、透明、包埋，连续切片，贴于备好的载玻片上，供HE染色，免疫组织化学染色及TUNEL法检测。
1.4 观察指标及测定方法
1.4.1 病理学检测：取制备的切片脱蜡，乙醇梯度复水4 min，苏木素染色，自来水冲洗，盐酸乙醇分化5次，自来水冲洗10 min，置伊红复染4 min，乙醇梯度脱水4 min，二甲苯透明10 min，树脂封片。光学显微镜下观察视网膜结构变化。
1.4.2 细胞凋亡检测：采用原位细胞凋亡检测（TUNEL）试剂盒检测细胞凋亡情况，具体操作按说明书进行。试剂盒购于公司。
1.4.3 Caspase-3的测定：采用SABC免疫组织化学染色法测定，具体操作按说明书进行。试剂盒购于武汉博士德生物公司。
1.5 观察结果：每只眼球取一张切片，每张切片取2个视野（面积为0.2 mm×0.2 mm）。细胞凋亡结果：计数视野中200个细胞并记录各组不同时间的细胞凋亡平均发生率，即凋亡指数（Apoptoticindex，Al）。免疫组化结果：计数单位视野内阳性细胞数。胞浆中出现的棕褐色颗粒为阳性细胞。
1.6 统计学处理：使用SPSS 16.0统计软件进行处理，各项参数以均数±标准差（
）表示，组间比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 光镜观察：正常组大鼠，视网膜组织层次清晰，神经节细胞呈单层密集排列，细胞体积较大。IR组神经节细胞数目较正常组减少，随时间推迟视网膜水肿加剧，各层细胞排列稍疏松，空泡样变，再灌注72 h视网膜结构基本恢复，但整个视网膜变薄。E2+IR组神经节细胞数减少程度、各层细胞损害程度均较IR组有所减轻。
2.2 TUNEL法检测凋亡细胞的表达：染色阳性的细胞呈棕褐色，体积减小。IR组6 h可见凋亡细胞随时间推移增多，再灌注24 h达高峰，48 h逐渐减少，72 h仍可见有阳性表达。E2+IR组在各个时间点上凋亡指数较IR组有所下降，两组各时点凋亡指数比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。详见表1。
表1 视网膜缺血再灌注损伤后不同时间点细胞凋亡指数（AI）
观察时间点 | 例数 | IR组 | E2+IR组 | t值 | P值 |
6 h | 8 | 5.32±0.42 | 4.12±0.38 | 5.544 | 0.000 |
24 h | 8 | 30.56±2.78 | 19.24±1.44 | 9.971 | 0.000 |
48 h | 8 | 14.41±0.94 | 10.39±0.81 | 9.163 | 0.000 |
72 h | 8 | 6.01±0.63 | 3.40±1.08 | 5.905 | 0.000 |
2.3 免疫组织化学染色结果：Caspase-3免疫组织化学染色：正常视网膜组织几乎无caspase-3蛋白表达。IR组再灌注6 h时可见少量caspase-3蛋白表达；再灌注24 h其表达渐达高峰；再灌注48 h阳性表达下降；72 h时仍可见少量表达。阳性细胞呈棕褐色染色。E2+IR组表达的阳性细胞数也随再灌注时间的延长而增多，但其表达量较IR组有所减少。详见表2。
表2 苯甲酸雌二醇对大鼠视网膜缺血再灌注损伤后caspase-3蛋白表达的影响（）
观察时间点 | 例数 | IR组 | E2+IR组 | t值 | P值 |
6 h | 8 | 8.01±0.83 | 6.59±0.74 | 3.611 | 0.005 |
24 h | 8 | 33.62±4.21 | 25.33±2.87 | 4.602 | 0.000 |
48 h | 8 | 17.24±1.28 | 12.46±0.88 | 8.704 | 0.000 |
72 h | 8 | 9.68±0.92 | 7.25±1.24 | 4.451 | 0.000 |
3 讨论
视网膜中央动脉为视网膜血供的终末动脉，极易缺血，并可迅速导致视网膜严重损伤，使其功能和结构发生改变。本实验通过前房灌注加压法造成再灌注损伤动物模型，光镜下观察视网膜形态随再灌注时间的推移而发生的变化：正常大鼠视网膜组织结构层次清晰，而RIRI组视网膜组织细胞排列紊乱，且各层出现不同程度的水肿，空泡，再灌注损伤后期视网膜组织结构逐渐恢复，但整个视网膜组织变薄，细胞丢失，这与文献报道相一致[1]。E2+IR组视网膜形态较RIRI组有不同程度的改善，为雌激素对RIRI起保护作用提供了形态学依据。
视网膜细胞的死亡被认为包括坏死和凋亡两种方式，其中细胞凋亡被认为是视网膜缺血再灌注损伤后神经细胞损伤的主要方式。本实验研究显示：正常大鼠视网膜组织各层未见明显的凋亡细胞，而造模成功后，于视网膜神经节细胞层，内核层，内丛状层可见明显的凋亡细胞，表示再灌注损伤中存在细胞凋亡，与文献报道一致。细胞凋亡是多种因素共同作用的结果，如：缺血缺氧，氧自由基的形成，钙离子超载，多种细胞因子等，其中凋亡执行基因caspases家族被认为参与了细胞凋亡的发生，而caspase-3作为家族中的一员，处于凋亡的下游阶段，被激活后，进一步激活核酸内切酶，破坏细胞骨架中蛋白质，致使凋亡发生[2]。本实验使用免疫组织化学方法检测到caspase-3蛋白的表达，且其表达趋势随时间的延长而增加，24 h表达达高峰，48 h后表达渐下调，但E2+IR组在24 h，48 h时较RIRI组明显下调（P＜0.01）。上述结果表明苯甲酸雌二醇能减少大鼠视网膜组织缺血再灌注损伤过程中的细胞凋亡数，使caspase-3蛋白的表达下调，与文献报道基本一致[3]。
总之，苯甲酸雌二醇可减轻视网膜缺血再灌注损伤所致的视网膜水肿，减少再灌注损伤所引起的细胞凋亡数，细胞凋亡执行基因caspase-3蛋白表达下调可能是其重要机制之一。但苯甲酸雌二醇的给药剂量，给药途径，给药时间，药物不良反应等多项问题仍需进一步的实验研究。
4 参考文献
[1] 詹宇坚,古继红.视网膜缺血再灌注损伤的实验研究进展[J].中国中医眼科杂志,1998,8(2):250.
[2] 姜文静,牛膺筠,赵 颖,等.视网膜缺血再灌注损伤后caspases家族的表达及bFGF对其的影响[J].临床眼科杂志,2006,14(5):462.
[3] 毕 燃,庞东渤.α-硫辛酸对视网膜缺血再灌注损伤中caspase-3表达的影响[J].眼科新进展,2008,28(9):665.