【关键词】 激光
关键词: 激光;大鼠;脊髓;降钙素基因相关肽
摘 要:目的 研究10mW氦氖（He-Ne）激光照射对大鼠坐骨损伤神经后脊髓CGRP表达的影响. 方法 96只SD大鼠制成坐骨神经损伤模型，He-Ne激光照射损伤的坐骨神经，免疫组化方法观察脊髓内CGRP的变化. 结果 神经损伤后1d脊髓内CGRP表达即增加;2wk及4wk时激光照射组CGRP的表达高于对照组，阳性表达主要存在于脊髓灰质内前角运动神经元和背根感觉纤维;8wk时CGRP仍保持较高水平的表达，二组无明显差异. 结论 10mW He-Ne激光照射大鼠损伤的坐骨神经可引起脊髓内神经元CGRP表达的变化，有促进完成神经再生的作用.
Keywords:laser;rat;spinal cord;calcitonin gene-related peptide
Abstract:AIM To study the expression of calcitonin gene-related peptide（CGRP）in spinal cord after irradiation on in-jured sciatic nerve of rat by He-Ne laser with output power of10mW.METHODS Injured sciatic nerves，made in96SD rats，were irradiated by He-Ne laser.The changes of CGRP in spinal cord were immunohistochemically studied.RE┐SULTS Expression of CGRP increased in spinal cord on the first day after injury of sciatic nerve.More expression of CGRP in second and fourth week was observed in laser irradi-ation group compared to control group.The positive sub-stance was mainly found in motor neuron in anterior horn and sensory nerve fiber in posterior horn.At eighth week，CGRP remained a high expression in both groups，and showed no significant difference.CONCLUSION Expression of CGRP in spinal cord can be changed by He-Ne laser irradiation with power output of10mW on injured sciatic nerve in rat.He-Ne laser irradiation can promote nerve regeneration.
0 引言
He-Ne激光有广泛的生物学作用，动物实验和临床观察均证实激光照射有促进外周神经生长的作用［1］ ，其作用机制尚待探讨.降钙素基因相关肽（cal-citonin gene-related peptide，CGRP）是由37个氨基酸残基组成的神经多肽［2，3］ ，起着递质或细胞外调节物样作用，由降钙素基因家族编码，但化学结构、体内分布及生物活性不同于降钙素，主要分布在神经系统中［4］ ，具有舒血管作用，在神经再生过程中起一定作用［5］ .我们观察了He-Ne激光照射损伤大鼠坐骨神经后脊髓CGRP表达的变化.
1 材料和方法
1.1 动物模型及照射方法 SD成年雄性大鼠96只，体质量（250±20）g，10g L -1 戊巴比妥钠（30mg kg
-1 ，ip）麻醉，常规消毒，取右侧股后外侧暴露坐骨神经，于神经分叉上0.7cm处眼科剪剪断，并修剪神经断端的覃状头，原位吻合以9个0的丝线缝合神经外膜4～6针，吻合后创口内放入庆大霉素2万单位关闭创口，对等分激光照射组和对照组各48只处理.He-Ne激光器（西安产）波长632.8nm，激光照射组照射功率为10mW，每次使用前激光功率计检测激光器的功率输出.照射时光斑直径0.6cm，功率密度为35.39mW cm-2 ，对准神经吻合处每次照射10min，照射能量密度为21.23J cm-2 ，对照组做相同处理，激光照射功率输出为0mW，每日1次，连续10d.
1.2 免疫组织 分别从照射1d开始，于照射前、照射后1，3d，1，2，4，6和8wk，照射组和对照组各取6只大鼠，10g L-1 戊巴比妥钠2mL，ip，待大鼠麻醉后，依次剪开胸腔、右心房、心室，而后剪开左心室，将输液管通过左心室插入主动脉内，生理盐水快速灌注150mL，40g L-1 多聚甲醛快速灌注200mL，缓慢滴注300mL，持续1.5～2h，而后取坐骨神经及相应脊髓，浸入200g L-1 蔗糖液（0.01mol L-1 PB）4℃过夜，恒冷箱切片，片厚30μm.用0.01mol L-1 PBS清洗10min×3→浸入含3g L-1 Triton×100的0.01mol L -1 PBS30min→0.01mol L
-1 PBS清洗10min×3→加羊抗CGRP（1 2000，Sigma）4℃孵育48h，取出入0.01mol L-1 PBS清洗10min×3→加入兔抗羊抗体（1 200，Sigma）室温孵育2h→入0.01mol L-1 PBS清10min×3→浸入ABC复合物（1 500，Sigma）室温孵育2h，浸洗硫酸镍胺加强的DAB蓝色反应法显色、贴片、干燥、脱水、透明、中性树胶封片.应用Leica Q570c真彩色图像分析仪（德国），进行灰度定量分析，每张切片在损伤侧后角的第3，4板层选5个高倍视野进行阳性物质密度值测定，取测定数值减去背景测定数值的绝对值，t检验统计分析.
图1 － 图2 略
2 结果
成年大鼠腰骶段脊髓中CGRP阳性反应的细胞数目较少，每一切面多为有1～2个CGRP阳性反应细胞，均为前角运动神经元，染色较淡，无明显阳性纤维，阳性反应细胞多为大细胞，呈圆形或多角形，树突较短，阳性物质主要集中在胞质，胞核为阴性.坐骨神经损伤后1d即发现损伤侧CGRP阳性反应增强，1wk以内激光照射组和对照组无明显差异，此时神经元突起明显，少量神经元间有较长的阳性纤维，后角CGRP阳性反应纤维较多.2wk时激光照射组CGRP阳性反应较对照组更明显，前角运动神经元阳性个数明显多于对照组（Fig1A，1B），细胞阳性染色较重，集中在胞质，胞体突起较多，有的细胞有较长的CGRP阳性纤维向外伸展，未损伤侧前角运动神经元阳性个数也少量增加.损伤侧后角阳性纤维排列密集，走形较杂乱，纤维上有较多的CGRP阳性膨体，呈串珠状（Fig2A，2B），脊髓后角第3，4脊髓板层内损伤侧CGRP反应阳性的灰度值测定（Tab1），显示第2，4周时激光照射组高于对照组（P<0.01），第6周时仍保持较高水平，第8周时激光照射组与对照组已无明显差异，但均高于正常水平.
表1 脊髓后角CGRP阳性反应的灰度值 略
3 讨论
He-Ne激光是波长632.8nm的相干光，有广泛的生物学效应，作用于生物组织可使生物膜分子构象发生改变，改变膜受体结构，使细胞活性发生变化，有明显的生物学刺激作用［6］ .
神经修复是一个较为复杂的过程，外周神经元损伤后可产生一系列的化学和组织学变化，一般认为，在这种变化中，与神经递质代谢有关的酶蛋白的合成下调，而与轴突存活和修复有关的结构蛋白的合成增加，如神经生长因子（NGF）［7］ 和生长相关蛋白（GAP-43）［8］ 的表达.外周轴突损伤后，可导致CGRP在运动神经元中含量增高，而He-Ne激光作为一种外界物理因子，通过其生物刺激作用使脊髓内CGRP表达增高.激光照射组2wk时前角运动神经核团CGRP阳性反应较对照组更强烈，阳性细胞数目明显多于对照组，激光照射组的后角阳性神经纤维密集，数量多，染色重，较对照组阳性物质明显增多.神经元产生的CGRP作为一种信号作用于胶质细胞，触发神经元与胶质细胞间的反应，从而促进神经元的存活与修复再生.另有研究发现CGRP对神经细胞具有明显的营养作用，运动神经元疾病的脊髓和脑细胞核中CGRP免疫反应明显降低［9］ ，也提示了CGRP对神经细胞具有营养作用.一般认为胶质细胞上存在CGRP受体［10］ ，而CGRP可能是神经和胶质细胞间作用的一种调质，CGRP首先与胶质细胞上的受体结合，刺激膜上的cAMP合成增生，进而激活c-fos基因的表达，c-fos基因又可诱导胶质细胞的纤维酸性蛋白（GFAP）的基因表达，促进GFAP的合成，胶 质细胞还能形成或分泌NGF，促轴突因子、胰岛素生长因子（IGF）等多种神经营养因子，这些因子能促进中枢神经和周围神经轴突的生长和存活，在神经修复再生过程中起重要作用.
完整的神经元和外周组织分别对CGRP的合成产生正反馈和负反馈作用.正常情况下，它们处于一种平衡状态，当外周神经损伤后，失神经支配的肌肉组织失去了对CGRP合成的抑制作用，而致神经元中CGRP合成增多，有利于神经的再生.CGRP是强烈的血管舒张因子［11］ ，CGRP的增多可增加损伤运动神经元和轴突的血液供应，亦有利于神经的再生，但CGRP的舒血管作用机制尚未明确.另外，CGRP有明显抗缺血及抗自由基损伤的保护作用，在神经再生中亦不可忽视.激光照射后未损伤侧脊髓内CGRP阳性反应细胞亦明显增多，激光照射治疗后机体可有整体效应，其机制需进一步探讨.坐骨神经损伤后1d脊髓内CGRP水平即增高，1wk达到较高水平，而第8周时大部分大鼠的肢体功能包括肌力、展趾功能基本恢复时，CGRP仍有较高水平的表达，说明CGRP是神经修复过程中较为敏感的因素，对神经损伤及外周物理因子的刺激反应较为敏感.神经损伤早期，激光照射组与对照组之间无明显差异，而第2周到第4周激光照射停止后，激光照射组CGRP表达明显高于对照组，说明神经损伤早期，损伤本身的刺激在CGRP表达中占主导作用，而激光照射作为外界物理因子刺激起次要作用.随着时间延长，物理因子刺激逐渐发挥主要作用，激光照射组第4wk时CGRP仍有较高的表达说明激光照射停止后其生物学刺激作用仍然存在.CGRP的调控非常复杂，它的基因前体选择性剪接的不同，在不同组织中表达为降钙素（CT）或CGRP，低功率激光作为一种物理因子刺激可改变CGRP的表达，但其在CGRP调控中的作用尚需进一步研究.
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