不同途径骨髓基质干细胞移植治疗小鼠糖尿病效

【关键词】 骨髓祖代细胞;骨髓移植;糖尿病;小鼠

【摘要】 目的 研究不同途径骨髓基质干细胞(bmscs)移植对小鼠糖尿病治疗效果。方法 分离骨髓，贴壁培养并纯化和扩增bmscs。腹腔注射链脲佐菌素建立小鼠糖尿病动物模型。取2×105个第3代bmscs，对模型鼠分别进行胰腺内多点注射、尾静脉移植以及肾被膜移植。动态观察移植后小鼠的血糖、体质量及行为的变化。结果 与糖尿病对照组相比，胰腺移植组、尾静脉移植组和肾被膜移植组小鼠的糖尿病症状有所改善，血糖明显降低(f=32.58～48.35，q=10.06～14.98,p<0.05)，以胰腺移植组血糖下降更为显著。结论 3种途径bmscs移植对小鼠糖尿病均有治疗作用。

【关键词】 骨髓祖代细胞;骨髓移植;糖尿病;小鼠

　therapeutic effect of differentpathway transplantation with bone marrow mesenchymal stem cells on diabetes in mice jia yuewei, liu xiaoping, yu yejun, et al (department of histology and embryology, qingdao university medical college, qingdao 266021, china); [abstract] objective to study the therapeutic effects of different ways of bmscs transplantation on diabetic mice. methods mouse bmscs were isolated, cultured and purified. a model of diabetes in mice was created by intraperitoneal injection of streptozotocin. about 2×105 bmscs of third generation were injected into the pancreas, caudal vein and renal capsule. blood glucose levels, body weight, and behavior were observed after transplantation of bmscs. results compared with the control group, the diabetic symptoms of those treated with bmscs transplantation improved and blood sugar decreased (f=32.58-48.35,q=10.06-14.98,p<0.05), especially for those received bmscs transplantation in the pancreas. conclusion all the three ways of bmscs transplantation were effective in the treatment of diabetes in mice.

　　[key words] myeloid progenitor cells; bone marrow transplantation; diabetes mellitus; mice

　　目前，传统治疗糖尿病的方法只能减轻症状，但不能根治，病人一般需要终身治疗，给工作和生活带来了极大的不便。wwW.133229.cOm由于给药过程中病人缺乏理想的血糖感应系统，常导致全身性代谢紊乱并继发眼、肾、神经、心血管等重要器官损害。胰岛移植是治愈1型糖尿病最有希望的方法，但是由于供体不足和免疫排斥反应等问题，始终不能广泛应用于临床。干细胞具有极强的自我更新能力及多向分化的潜能，能形成各种组织的早期未分化细胞，是各类疾病细胞治疗和基因治疗的首选种子细胞[1]。骨髓基质干细胞(bmscs)取材方便，体外易扩增，不涉及伦理问题，免疫排斥反应轻，具有向骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、心肌细胞、神经细胞、胰岛素分泌细胞等多向分化的能力[25]。因此，bmscs可能成为细胞移植治疗糖尿病的理想的细胞来源。目前有关干细胞在胰腺内分化的研究，主要采用尾静脉移植、肾被膜移植、肝门静脉移植、胰腺内多点注射进行干细胞移植，其研究侧重于探索干细胞移植后胰腺基因和蛋白的表达，很少进行功能学方面的研究。本实验重点对比研究了胰腺内、尾静脉和肾被膜3种途径进行bmscs移植对糖尿病的治疗效果。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　取wistar大鼠10只，体质量为150～200 g;取健康昆明种小鼠25只，2月龄，体质量为35 g左右，均来自青岛市药品检验所。dmemlg培养基购自gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;胰蛋白酶购自sigma公司;链脲佐菌素(stz)购自sigma公司。怡成jps5型血糖仪购自怡成生物电子技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠bmscs的分离、培养和标记 采用颈椎脱臼法将wistar大鼠处死。在无菌条件下分离出双侧胫骨和股骨，用dhanks液清洗干净，除去骨表面附着组织和两端的骨骺端，暴露骨髓腔。用含体积分数0.10胎牛血清的dmemlg培养液反复冲洗骨髓腔。将收获的骨髓制成单细胞悬液。调整细胞密度为1×1010/l，接种于50 ml培养瓶中，在37 ℃、体积分数0.05、饱和湿度的co2培养箱中培养。24 h后换液，除去未贴壁的细胞，每隔3 d换液一次。当细胞达到80%融合时传代。在第3代bmscs培养第3天时加10 μl的brdu溶液(brdu 50 mg，二甲基亚砜0.8 ml，双蒸水1.2 ml)[6]。

　　1.2.2 糖尿病动物模型的建立 取昆明种小鼠25只，雌雄各半，给药前禁食12 h，按180 mg/kg剂量一次性腹腔注射stz[7]。stz注射前用ph 4.5的0.1 mmol/l柠檬酸钠缓冲液配制成10 g/l的溶液。稳定3 d后，随机检测血糖，血糖连续2次大于16.7 mmol/l，出现糖尿病症状，说明造模成功。小鼠造模时死亡1只。

　　1.2.3 干细胞移植 将24只糖尿病小鼠分为胰腺移植组、尾静脉移植组、肾被膜移植组及糖尿病对照组，每组6只。取第3代1×109/l的bmscs，重悬于pbs中，分别于尾静脉、胰腺包膜下、肾被膜下各注射0.2 ml干细胞悬液;糖尿病对照组不接受任何处理。小鼠移植后不给予任何抗排斥反应药物，正常摄食和饮水。

　　1.2.4 移植后血糖的测定 采用怡成jps5型血糖仪，于移植后的第3、7、14、28、42天，采尾静脉血测量血糖。

　　1.2.5 统计学处理 采用ppms 1.5[8]软件进行处理，数据以±s表示，各组间比较行方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 bmscs的生长情况

　　刚分离的骨髓细胞呈圆形，折光性强，大小不一，不能辨认细胞核。接种24 h后，可见部分圆形细胞以散在的方式贴壁，贴壁细胞有小的突起。2～3 d细胞开始增殖，可见一些分散的集落形成。至14 d时，集落中心细胞密集，周围细胞呈放射状或漩涡状排列，细胞之间无接触抑制现象，集落间出现重叠。传代培养的细胞在0.5 h后开始贴壁，3～4 h后贴壁基本完成，贴壁细胞很快铺展，较原代细胞体积变大，并且不再以集落的方式生长，而是呈均匀分布生长。传至第3代时，细胞形态较为单一，呈长梭形贴壁生长，以平行排列生长为主或呈漩涡状生长。

　　2.2 糖尿病模型鼠的症状

　　腹腔造模后至细胞移植前，有1只小鼠死亡，其余全部存活。造模后3 d, 小鼠出现多饮、多尿、体质量缓慢下降表现，而且精神萎靡，毛色不顺滑，甚至出现打结现象。

　　2.3 小鼠造模前后体质量的变化

　　小鼠造模前的平均体质量为(33.60±2.99)g，造模后的平均体质量为(31.60±2.79)g，移植后的平均体质量为(33.80±2.49)g，各组小鼠的体质量变化无统计学意义。

　　2.4 不同移植途径对小鼠血糖水平的影响

　　尾静脉移植组、肾被膜移植组、胰腺移植组与糖尿病对照组相比较，血糖都有所降低(f=32.58～48.35，q=10.06～14.98,p<0.05)，以胰腺移植组血糖下降更为显著。见表1。表1 bmscs移植前后各组血糖水平

　　3 讨 论

　　胰岛移植是治愈1型糖尿病最有希望的方法，但是由于供体不足和免疫排斥反应等问题，始终不能广泛应用于临床。bmscs具有向多种细胞系转化的潜能。正常情况下，bmscs大多处于休眠状态，在病理状态或外因诱导下可表现出不同程度的再生和更新能力，不仅可分化为造血组织，还可以向多种造血以外的组织迁移、定位，并分化为相应的组织细胞[9]。

　　最新研究表明，骨髓中存在可以分化为胰腺组织细胞的基质干细胞[10]。本研究结果表明，不同途径bmscs移植14 d左右，糖尿病小鼠多饮、多食、多尿的症状有所好转，血糖也开始下降，体质量有所增加，提示3种途径的干细胞移植可以改善糖尿病模型模型鼠的胰岛功能。bmscs移植后，糖尿病模型鼠的血糖下降，可能与下列原因有关：①bmscs可能分泌多种细胞因子，从而促进自身胰岛的增殖、修复[11];②bmscs迁移至胰腺组织内，刺激胰腺内的干细胞增殖、分化，自身分化为胰岛素分泌细胞，代偿胰岛功能[12];③bmscs可以促进血管的生成，从而改善微环境，有利于残留胰岛的修复[13]。

　　本文结果表明，早期3种不同的移植途径均能使糖尿病小鼠的血糖下降，糖尿病症状有所改善，但改善的效果差异无显著性。随着干细胞移植时间的延长，胰腺内移植对血糖的降低效果明显优于尾静脉移植和肾被膜移植，这可能与到达胰腺的bmscs的数量有关。虽然血液循环中干细胞可以向特定的损伤器官迁移，但由于各个器官的组织结构和血液循环特点不同，通过尾静脉移植的细胞，可以通过血液循环到达各个器官，部分干细胞可以在某些器官中滞留，减少了到达胰腺的干细胞数量[14]。肾被膜作为免疫特许区，使移植细胞免受免疫攻击;其血运丰富，又可以形成稳定的微环境，既能供应移植细胞的营养，也使部分移植细胞便于感受血糖的变化，向外分泌胰岛素，从而发挥降糖作用。而胰腺内多点注射，除了可以保证胰腺组织中bmscs的数量，还可以使bmscs与受损胰腺的微环境充分接触，在损伤胰腺微环境的诱导下，促使bmscs分化为胰岛素分泌细胞;同时，可以直接刺激胰腺内的干细胞增殖分化为功能细胞;并可促成血管的生成，改善微环境，有利于残留胰岛的修复，从而发挥较好的降糖作用[15]。

　　虽然胰腺移植效果优于尾静脉移植及肾被膜移植，但是由于胰腺组织的特殊性，直接注射有可能导致胰腺组织水肿、坏死，且操作复杂，很难在临床开展。因此，如何促进干细胞向靶器官迁移，提高干细胞移植的效果，仍是细胞替代治疗所面临的难题

【参考文献】
　[1]张文杰，曹谊林. 组织器官重建的基础：干细胞[j]. 中国医学科学院学报， 2005,27(6):662664.

　　[2]余勤，边俊兰，郭莹. 丹参注射液诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究[j]. 中国中西医结合急救杂志, 2006,13(4):210213.

　　[3]bianco p, robey p g, simmons p j. mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays[j]. cell stem cell, 2008,2(4):313319.

　　[4]刘斌钰,李宁毅. 大鼠骨髓间充质干细胞的培养鉴定及向成骨细胞诱导分化研究[j]. 齐鲁医学杂志, 2007,22(3):215220.

　　[5]oh s h, muzzonigro t m, bae s h, et al. adult bone marrowderived cells transdifferentiating into insulinproducing cells for the treatment of type 1 diabetes[j]. lab invest, 2004,84(5):607617.

　　[6]李连达,吴理茂,刘红,等. 大鼠骨髓间质干细胞的培养和生物学特性[j]. 科学技术与工程, 2003,3(6):547550.

　　[7]王芳,朱大菊. 链脲佐菌素在糖尿病鼠模型中的应用及其作用机制[j]. 勋阳医学院学报, 2004,23(1):1517.

　　[8]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件ppms 1.5的组成和应用特点[j]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(1):2932.

　　[9]李爱梅,邓钢. 骨髓间质干细胞体外分化为胰岛细胞的研究进展[j]. 介入放射学杂志, 2005,14(4):433435.

　　[10]tang d q, cao l z, burkhardt b r, et al. in vivo and in vitro characterization of insulinproducing cells obtained from murine bone marrow[j]. diabetes, 2004,53(7):17211732.

　　[11]hess d, li l, martin m, et al. bone marrowderived stem cells initiate pancreatic regeneration[j]. nat biotechnol, 2003,21(7):763770.

　　[12]ianus a, holz g g, theise n d, et al. in vivo derivation of glucosecompetent pancreaticc endocrine cells from bone marrow without evidence of cell fusion[j]. clin invest, 2003,111(6):843850.

　　[13]mathews v, hanson p t, ford e. recruitment of bone marrowderived endothelial cells to sites of pancreatic betacell injury[j]. diabetes, 2004,53(1):9198.

　　[14]kocher a a, schuster m d, szabolcs m j, et al. neovascularization of ischemic myocardium by human bone marrow derived angioblasts prevents cardiomyecyte apoptosis, educes remodeling and improves cardiac function[j]. nat med, 2001,7(4):430436.

　　[15]liechty k w. human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site specific differentiation after in utero transplantation in sheep[j]. nat med, 2000,6(11):12821286.