【关键词】 骨髓间充质干细胞;电离辐射;胸腺;dapi
【摘要】 目的 观察骨髓间充质干细胞(mscs)在电离辐射诱发的胸腺组织损伤中的迁徙、定居作用。方法 c57bl/6小鼠12只，随机分为对照组和照射组，每组6只。照射组小鼠经1.75 gy x线全身照射，每周1次，连续4 w，制备电离辐射诱发的胸腺组织损伤动物模型。体外分离培养小鼠mscs，dapi标记，照射组小鼠尾静脉注入mscs 4.0×105个/只，分别于注入mscs后1、5及10 d处死小鼠，取胸腺组织在激光共聚焦显微镜下观察mscs在胸腺组织中定位情况。结果 对照组小鼠胸腺组织皮髓质结构清楚，皮质内有大量的淋巴细胞，髓质内存在少量淋巴细胞;照射组胸腺组织皮髓质结构不清，淋巴细胞广泛坏死。照射组小鼠注入mscs1 d后，mscs即出现在胸腺组织内，5 d后开始点状分布，10 d后大量分布。结论 mscs可以迁徙至损伤的胸腺组织中，对胸腺组织具有修复作用。
【关键词】 骨髓间充质干细胞;电离辐射;胸腺;dapi
骨髓间质干细胞(mscs)连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能〔1〕。mscs表达组织相容性复合物ⅰ，而缺乏组织相容性复合物ⅱ，免疫原性较弱，已成为细胞治疗和组织工程的理想种子细胞。Www.133229.cOm研究表明，创伤可以刺激mscs迁移至受损器官或组织，并有助于受损组织修复和重建〔2〕，将mscs注入脑缺血性损伤的大鼠模型内可以参与脑组织的修复〔3〕，并且异基因mscs对组织损伤也有修复作用〔4〕。但有关mscs在辐射诱发的组织损伤中的作用报道甚少。本研究通过体外培养扩增c57 bl/6小鼠mscs注入电离辐射损伤模型小鼠，观察其移植后在胸腺组织中的迁徙、定居情况。
1 材料与方法
1.1 动物
c57bl/6小鼠，清洁级，雌雄各半，体重(16±2)g，由吉林大学实验动物中心提供，随机分为对照组和照射组，每组6只。
1.2 试剂与仪器
dmem培养基(gibco公司)、胎牛血清(hyclone公司)、胰蛋白酶(gibco公司)和dapi(sigma公司)。倒置显微镜(日本olympus)、冰冻切片机(德国莱卡)、激光共聚焦显微镜(日本olympus)。
1.3 模型制备
照射组小鼠采用fcc7000型同中心回转式60co治疗机(山东新华医疗器械股份有限公司)进行大剂量全身照射。条件：电压200 kv，电流10 ma，滤板0.5 mm cu和1.0 mm al。球靶距50 cm，剂量率0.287 gy/min，照射时间366 s/次，总剂量1.75 gy。1次/w，共4 w。对照组小鼠正常饲养。
1.4 胸腺组织观察
末次照射后，处死小鼠，取出胸腺，置于10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片厚度5 μm，he染色，普通光学显微镜观察。
1.5 bmscs的分离、培养、鉴定及标记
参照文献〔5〕方法采用全骨髓直接贴壁筛选法分离培养mscs并传代，流式细胞术检测细胞表型，应用成骨细胞诱导液和脂肪样细胞诱导液诱导mscs定向分化，鉴定其分化能力。
1.6 mscs细胞在胸腺组织移植及定位的观察
照射组小鼠末次照射后，经尾静脉注入mscs 4.0×105个/只，注入后1、5和10 d，处死小鼠，取胸腺组织，冰冻切片机切成2 μm的切片，贴附于玻片上，室温干燥10 min，丙酮固定10 min，激光共聚焦显微镜下观察mscs在胸腺组织内的定位情况。
2 结 果
2.1 胸腺组织学观察
见图1。正常小鼠胸腺组织皮髓质结构清楚，皮质内有大量的淋巴细胞，髓质内存在少量淋巴细胞。照射组皮髓质结构不清，淋巴细胞广泛性坏死。图1 胸腺的组织学改变(×100)
2.2 bmscs的分离、培养及鉴定
全骨髓细胞培养5 d，可见贴壁细胞增殖明显，细胞形态较均一，大部分呈梭形，7 d左右可传代。经2～3次传代后细胞呈单一梭形的成纤维样细胞，经流式细胞仪检测mscs表面不表达cd34，在特定诱导液作用下，可以向成骨细胞及脂肪细胞分化。
2.3 mscs在胸腺组织移植及定位
辐射诱发的胸腺损伤模型鼠注入mscs 1 d 后胸腺组织内可见少量的蓝色荧光存在，表明mscs出现在胸腺组织内;5 d 后在胸腺组织内蓝色荧光开始点状出现;10 d 后在胸腺组织内广泛出现大量荧光(图2)，提示mscs可以迁徙到受损伤的胸腺组织内。图2 小鼠胸腺组织内mscs的迁徙及定位(×100)
3 讨 论
造血和免疫功能的破坏与抑制是电离辐射的主要病理损伤之一，因此，减轻造血和免疫器官的损伤和促进其恢复是缓解辐射损伤效应的关键。胸腺不仅是机体中枢淋巴器官之一，也是细胞免疫中起重要作用的 t细胞的发育场所，是辐射致癌的“靶器官”。因此,保护淋巴细胞免受辐射损伤，促进损伤后修复，对增强机体免疫有着切实的意义。移植细胞标记是研究其在活体内的定植所不可或缺的，目前常用的标记法有dapi标记、brdu 标记法、染色体标记法和基因标记法〔6〕。dapi为一种荧光材料，可以透过完整的细胞膜，能快速进入活细胞中与细胞核中的双链dna结合，标记效率高，且对活细胞无毒副作用〔7〕。研究表明，dapi起初标记率很高(接近100%)，1 w内可维持80%～90%标记率〔8〕。dapi标记细胞操作简便，敏感性好，可以直接观察，费用低廉，因此，得到广泛应用。本研究采用dapi进行细胞标记后，荧光显微镜下见所有mscs 均被标记, 提示dapi标记法敏感性好，标记效率高。
骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，体外扩增的mscs植入体内后可长期存活，并且在损伤环境下还可以被诱导扩增，参加组织修复或者再生反应。chapel等〔9〕将msc移植治疗全身不均匀照射的短尾猴后，在损伤的肌肉、皮肤、骨髓和肠道等组织检测到标记细胞的存在。devine等〔10〕对幼年狒狒进行致死剂量照射后输入自身或异体msc后，在胃肠道、肾脏、肺脏、肝脏、胸腺和皮肤中组织均可检测到msc。本研究显示，照射组小鼠经尾静脉注入mscs后，mscs可以聚集到受损伤的胸腺组织内，提示移植入体内的mscs对辐射诱发的损伤组织会有产生修复作用。
综上所述，本研究成功分离培养了小鼠mscs，采用尾静脉法将mscs移植到辐射损伤模型小鼠体内，经荧光染色及激光共聚焦观察显示，移植的mscs向损伤部位聚集，并在宿主体内存活，为mscs在修复电离辐射的损伤作用提供了实验依据。
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