【摘要】 目的：通过体内、外实验，研究骨髓基质干细胞（bmscs）对实验性自身免疫性脑脊髓炎（eae）的治疗作用及其机制。方法：建立lewis大鼠eae动物模型，在免疫后第6天尾静脉回输pkh26标记的bmscs，于发病高峰期处死大鼠，组织取材。通过临床评估、荧光示踪、免疫学病理学等方法检测，评估bmscs对eae的治疗作用及其机制。同时在体外用化学方法诱导bmscs向少突胶质细胞分化，观察其分化的情况。结果：通过尾静脉回输，bmscs能够聚集到病变部位，并发生分化。与对照组相比，回输组大鼠发病临床评分较低，中枢神经系统脱髓鞘的病理改变和炎性细胞浸润减轻，cd4+和cd8+t细胞表达明显减少（p<0.05），血清及淋巴细胞培养上清中ifnγ和tnfα的分泌水平显著降低（p<0.05），il4的分泌水平显著升高（p<0.05）。体外诱导72小时未见到bmscs向少突胶质细胞分化；4天后45%的bmscs发生分化。结论：在体外bmscs通过化学诱导可以向少突胶质细胞分化；在体内bmscs能向病变部位迁移，并部分分化成少突胶质细胞，同时bmscs通过调节免疫系统的炎症细胞因子表达、cd4+和cd8+t细胞数和th1和th2细胞平衡，对eae起治疗作用。
【关键词】 eae bmscs 分化 细胞因子
study on treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis by bone marrow stromal cells
li hulun,sun bo, mu lili, liu xijun, wang dandan, zhao kai, jin lianhong.
department of neurobiology,affiliated hospital of tongji medical college,huazhong university of science and technology,wuhan 430000,china
［abstract］objective:to investigate the therapeutic effects of adoptive transfering bone marrow stem cells(bmscs)for the experimental autoimmune encephalomyelitis(eae)and the related mechanisms underlying,and to investigate the differentiation of bmscs under oligodendroglial cell microenvironment induction both in vivo and vitro.methods:establishing the microenvironment and stimulating bmscs in vitro. immunizing lewis rats to establish eae. in the treatment group, marked bmscs were injected into the rat tail vein 6 days after immunization. evaluating the corresponding indexes of eae by clinical assessment, immunohistochemistry, elisa and so on, thoroughly discussing the pathogenesis and the therapeutic effects of bmscs to eae.results:72 hours after stimulating with cytokine in vitro, there were no bmscs to differentiate to oligodendrocyte. then 4 days later,45% bmscs differentiated to oligodendrocytes. bmscs could also migrate to the spinal cord where demyelination occurred. by injecting bmscs into the rat tail vein,patholoqical demyelination of central nerve system and inflammatory infiltration were lighten to some extent.the amount of cd4+ and cd8+t cells and the concentrations of ifnγ and tnfα in the sera significantly decreased（p<0.05）, while that of il4 increased significantly（p<0.05）.conclusion:bmscs have the capacity to migrate to the injured tissues and differentiate into oligodendrocyte. bmscs may reverse the disbalance of th1/th2 cells by regulating the cytokines production to take an important part in treatment of eae.
［key words］eae；bmscs；differentiation；cytokines
多发性硬化(mutiple sclerosis，ms)是一种常见的中枢神经系统的脱髓鞘性疾病，发病原因尚不清楚［1］。wWw.133229.cOM目前认为ms是由cd4+t细胞介导的神经自身免疫性疾病，细胞因子网络调节失衡是导致疾病的关键因素。eae（experimental autoimmune encephalomyelitis）是公认的多发性硬化的实验动物模型，其临床症状、神经电生理和组织病理上与ms非常相似，是研究多发性硬化的良好模型。骨髓基质干细胞（bone marrow stem cells，bmscs）是一种具有很强的自我更新能力和分化潜能的成体干细胞，能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等［2，3］。既然ms累及中枢神经系统髓鞘，破坏少突胶质细胞，我们能否通过将bmscs回输到eae大鼠体内，使其分化成受损的细胞，修复组织损伤，以达到缓解疾病的目的？为了探讨以上问题，我们进行了实验。
在本实验中，我们建立eae动物模型，同时分离、纯化、标记同品系大鼠bmscs, 通过尾静脉回输bmscs，对bmscs进行示踪，并检测其是否存在分化，对eae发病情况进行评估，同时在体外检测bmscs分化成少突胶质细胞的能力，探讨治疗机制，为ms的治疗提供新的思路和方法。
1 材料与方法
1.1 材料
健康雌性lewis大鼠20只，体重150～160 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；mbp6886多肽合成于北京博奥森生物技术有限公司；pkh26、lfb购自sigma公司；n2购自gibco公司；fgf、bdnf购自pepro tech公司；mouse antirat cd4、mouse antirat cd8购自biolegend公司；mouse anti oligodendrocyte marker o4 monoclonal antibody购自chemicon 公司；antimousetric购自北京中山金桥生物公司；goat antimousehrp、fitc标记山羊抗小鼠igg购自中杉金桥公司；ifnγ、tnfα、il4 elisa试剂盒购自北京晶美生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 bmscs的分离、纯化及培养
无菌取lewis大鼠股骨和胫骨骨髓，制备细胞悬液，37℃、5%co2原代培养。3天后换液，待细胞长成集落后消化分散，以后细胞铺满培养瓶底80%～90%时传代，3代后，纯度达到95%。
1.2.2 体外诱导bmscs向少突胶质细胞分化及鉴定
将未成层bmscs（约5×105）用dmem、10%fbs、1 mmol/l βme的培养基培养24小时后，换成dmem、2%dmso、200 μmol/l bha的培养基培养2天。此时细胞呈球形，悬浮于培养液中。收集悬浮细胞于nb培养基中，加入n2和fgf(40 ng/ml)进行培养，每天更换fgf。培养7～15天后收集形成的神经球，上板置于nb培养基中，同时加入n2及fgf(20 ng/ml)，培养2天。更换刺激因子bdnf(20 ng/ml)培养72小时或4天后，固定，进行组化鉴定：pbs洗3遍后，滴加1∶50稀释的mouse monoclonal antibody o4，37℃作用30分钟，pbs洗后滴加1∶50稀释的antimousetric igg，37℃ 30分钟，pbs洗3次，晾干，荧光显微镜观察、照相、分析。
1.2.3 eae动物模型的建立
每只大鼠尾根部皮下注射含有25 μg mbp6886的混合免疫乳剂200 μl，隔天称重，观察发病情况，按照如下标准进行临床评分：0级：无异常；1级：尾部张力降低，尾尖上翘；2级：尾瘫，翻正反射部分缺失；3级：翻正反射缺失；4级：步态失调、姿态异常；5级：后肢轻瘫；6级：后肢中度瘫痪；7级：后肢严重瘫痪；8级：四肢瘫痪；9级：濒死；10级：死亡。
1.2.4 bmscs标记、回输
按照说明书步骤，用pkh26标记bmscs，于免疫后第6天，从尾静脉给lewis大鼠回输（约2×106个细胞/大鼠）。
1.2.5 组织取材
于发病高峰期处死大鼠，取出血、脊髓和淋巴结。将血离心，取出上清，-30℃冷冻保存。脊髓固定，分别截取颈段、腰段和骶段制备冰冻切片和石蜡切片。淋巴结制成单细胞悬液。
1.2.6 免疫组化检测中枢神经cd4+和cd8+的t细胞
取脊髓冰冻切片，冷丙酮固定20分钟，3%h2o2作用15分钟，0.1%triton x100溶液中作用20分钟，马血清封闭，室温1小时。加一抗：mouse antirat cd4（7 μg/ml）；mouse antirat cd8（7 μg/ml），4℃孵育过夜。加1∶250稀释goat antimousehrp，室温孵育2小时。dab显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明后封片，镜检。
1.2.7 elisa检测血清中ifnγ、tnfα、il4分泌水平
按照elisa试剂盒说明书步骤，将血清进行1∶10、1∶5和1∶1稀释、上板，分别检测ifnγ、tnfα和il4。
1.2.8 he染色及lfb染色检测中枢神经的炎细胞浸润和病理改变
脊髓的石蜡切片脱蜡至水，进行常规he染色，检测炎细胞浸润情况。同时进行lfb染色检测脊髓的脱髓鞘情况：将切片浸入lfb溶液中染色37℃过夜；0.005%碳酸锂分化10秒；70%酒精分化30～60秒；苏木素复染；脱水脱酒精，封片。
1.2.9 bmscs示踪和o4免疫组化双荧光标记
荧光显微镜检查脊髓冰冻切片标记红色荧光的bmscs，在同一张玻片上用少突胶质细胞表面标志o4进行免疫荧光组化染色，方法同1.2.2。荧光显微镜照相，叠加、分析。
1.2.10 t淋巴细胞增殖实验
将淋巴细胞（调整细胞浓度为2×106）培养到96孔板上，200 μl/孔。同时加入mbp6886（10 μg/ml）或cona（5 μg/ml），37℃、5%co2培养60小时，加入3hmethylthymidine(1 μci/孔)。37℃、5%co2培养24小时，收集细胞于玻璃纤维滤纸上，用βcounter检测。
1.2.11 数据的统计分析
统计结果采用x±s表示，组间比较采用t检验，用p<0.05、p<0.01或p<0.001表示差异的显著性。
2 结果
2.1 bmscs在体外经化学诱导分化成少突胶质细胞
体外化学诱导72小时后没有bmscs发生分化，少突胶质细胞表面标志o4免疫荧光组化检测阴性（图1a）；而4天后部分bmscs发生分化，o4免疫荧光组化检测发出红色荧光，约有45%的bmscs发生了转化（图1b）。
2.2 bmscs在体内能向神经损伤部位游走，并部分向少突胶质细胞分化
用红色荧光标记bmscs，回输到eae大鼠体内，在发病高峰期处死大鼠，取出脊髓组织制作冰冻切片，荧光显微镜观察，可以观察到部分bmscs向脱髓鞘神经组织周围迁移游走（图2b）；在同一张切片上作o4的免疫荧光组化，发现部分bmscs可以表达o4而呈现绿色荧光（图2a）。经分析叠加，pkh26标记的o4+ bmscs呈现出红色、绿色的叠加色——黄色荧光（image pro plus软件，media cybernetics 美国）（图2c）。
2.3 bmscs对eae的发病起治疗作用
bmscs回输组大鼠eae发病时间晚，症状轻，疾病最高平均得分与对照组比较有显著性差异（1.3±0.6 vs 6.7±
2.6, p<0.05），见图3。
2.4 eae的病理改变与炎性细胞的浸润
发病高峰期取出大鼠脊髓进行he及lfb染色，结果显示对照组大鼠脊髓中有较多炎性细胞浸润，脱髓鞘改变严重；而bmscs回输组大鼠体内炎性细胞浸润较对照组明显减少，脱髓鞘程度减轻，见图4。
2.5 免疫组化检测eae的cd4+t和cd8+t淋巴细胞的表达
发病高峰取中枢神经脊髓作cd4+t和cd8+t淋巴细胞免疫组化检测，并在100×显微镜下计数整个脊髓组织面积的阳性细胞数（单位：阳性细胞数/mm2），结果显示cd4+t、cd8+t细胞在回输组中的表达明显低于对照组，且均具有显著性差异（p<0.05）。在回输组中cd4+t/cd8+t细胞的值为1.23，低于对照组的1.53，见表1、图5和图6。表1 脊髓神经cd4+和cd8+t淋巴细胞的表达（略）
2.6 elisa检测外周血清和淋巴细胞培养上清中细胞因子的分泌水平 用elisa法检测血清ifnγ、tnfα、il4的分泌水平。结果显示，回输组的ifnγ、tnfα的分泌水平较对照组低，而il4的分泌则高于对照组，且与对照组比较ifnγ、tnfα和il4的分泌水平均具有显著性差异（p<0.05），见表2和图7。表2 ifnγ、tnfα、il4在血清中的分泌水平（略）
2.7 t淋巴细胞增殖实验 于发病高峰取淋巴结制成单细胞悬液，进行t淋巴细胞增殖实验检测，结果显示：对照组的cpm值明显高于回输组(p<0.05)，见表3和图8。表3 t淋巴细胞增殖实验（略）
3 讨论
bmscs作为一种具有多种分化潜能的干细胞，经许多研究证实，在体内或特定的体外培养条件下，可以分化为各种神经细胞，充分显示出其治疗神经系统疾病的潜能［4，5］。
最新研究表明将人bmscs静脉回输给eae小鼠，能够显著降低小鼠的死亡率及发病的严重程度。bmscs可以通过促进分泌神经生长因子（nerve growth factor, ngf）以及脑源性神经生长因子（brainderived neurotrophic factor, bdnf)恢复eae小鼠受损的神经细胞和神经功能。在长期观察中，bmscs回输组与非回输组小鼠相比，发病率和临床评分均有显著性差异［6，7］。但是，这些研究仅从bmscs促进神经细胞功能恢复角度探讨bmscs治疗eae, 没有涉及bmscs作为免疫系统调节因子，对eae的免疫调节作用。
为探讨bmscs对eae的治疗作用及其机制，我们尾静脉给eae大鼠回输bmscs，结果发现，回输组与对照组相比，在疾病的发生过程中，临床症状较轻，体重下降的趋势较缓，临床评分具有显著性差异（p<0.05）。在病理改变上，回输组中枢神经脊髓炎细胞浸润较少，髓鞘脱失程度较轻。这表明bmscs的回输，延迟了疾病的发生，同时降低了疾病的反应性。
在体外实验中能够检测到部分bmscs通过化学诱导可以转化成为少突胶质细胞；在体内，通过荧光标记示踪发现bmscs能够向受损部位迁移，并部分分化成少突胶质细胞。体内和体外的实验结果说明bmscs可以通过向损伤组织迁移并分化成少突胶质细胞修复受损髓鞘，降低eae发病。
cd4+t细胞在调节自身免疫性疾病中起了重要作用，在ms的急性发作期患者的脑脊液和血液中cd4+t细胞的数量明显上升，而cd8+t细胞的数量则明显下降［8］。本实验的cd4+t和cd8+t细胞免疫组化结果显示，回输组中cd4+t和cd8+t细胞的数量均低于对照组，有显著性差异（p<0.05）；对照组cd4+/cd8+值高于回输组。这提示我们bmscs还可能通过下调致敏的淋巴细胞的数量，降低机体的免疫反应，恢复cd4+/cd8+之间的平衡。虽然目前对cd8+t细胞在eae和ms的致病机制的研究中尚无确切的定论，但从本实验的研究结果可以看出，cd8+t细胞可以调节cd4+与cd8+之间的比例，降低机体的免疫反应，促进机体向平衡状态恢复。
cd4+t细胞可分为th1和th2两大类，相互作用, 彼此调节［9］。在eae及ms的研究中发现th1细胞所分泌ifnγ、tnfα等促炎性细胞因子的增加及th2细胞所分泌il4等抑炎性细胞因子减少，导致了th1/ th2细胞比例的失衡，这可能是ms及eae发病过程中的关键环节［1012］。eae时，活化的t细胞进入cns产生破坏性细胞因子ifnγ、tnfα等，它们可促进炎性介质的释放并直接或间接的杀伤少突胶质细胞，使髓鞘形成障碍，导致脱髓鞘［13］。il4可下调th1细胞的活性及炎性细胞因子的产生，从而促使eae恢复。
本实验elisa结果显示血清中，与对照组相比回输组的ifnγ、tnfα的浓度明显下降，而il4的浓度升高，并且均具有显著性差异（p<0.05）。这提示我们，bmscs通过调节t细胞的活性，减少th1细胞分泌细胞因子的量，下调其致炎活性；同时增加th2细胞分泌细胞因子的量，增强其免疫抑制作用，从而平衡紊乱的th1细胞和th2细胞的比例，促进疾病的恢复。而t细胞增殖实验结果同样显示bmscs下调了t细胞的增殖活性，可以对发生紊乱的免疫系统进行调节。
综上所述，我们认为bmscs通过两条途径来治疗eae：①bmscs可以游走到受损髓鞘受损部位，并部分分化成少突胶质细胞，修复受损髓鞘；②bmscs可以对免疫系统进行调节，降低促炎性细胞因子，促进抑炎性细胞因子，降低t细胞的增殖活性，逆转th1细胞与th2细胞的比例，抑制免疫反应。
bmscs对eae治疗的有效性，可以为此类自身免疫性疾病的治疗提供一条新的途径。同时，bmscs具有获取方法简单易行、体外扩增相对稳定及不存在抑制排斥反应等优点，是移植治疗的一种很好的选择。
【参考文献】
1 lutton j d, winston r, rodman t c. multiple sclerosis:etiological mechanisms and future directions ［j］. exp biol med(maywood),2004;229(1):1220.
2 huang s c, chen n j, heieh s l. isolation and charaterization of sizesieved stem cells from human bone marrow ［j］. stem cells, 2002; 20:249258.
3 pittenger m f, mackay a m, beck s c et al. multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells ［j］. science, 1999; 284(5411):143147.
4 chen j, li y, wang l et al. therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats ［j］. stroke, 2001; 32(4):10051011.
5 cuevas p, carceller f, dujovny m et al. peripheral nerve regeneration by bone marrow stromal cells ［j］. neurol res, 2002; 24(7):634638.
6 zhang j, li y, lu m et al. bone marrow stromal cells reduce axonal loss in experimental autoimmune encephalomyelitis mice ［j］. neurosci res, 2006; 84(3): 587595.
7 zhang j, li y, chen j et al.human bone marrow stromal cell treatment improves neurological functional recovery in eae mice ［j］.exp neurol,2005;195(1):1626.
8 karandikar nitin j, crawford michael p, yan x et al. glatiramer acetate(copaxone) therapy induce cd8+t cell responses in patients with multiple sclerosis ［j］. j clin investigat,2002;109(5):641649.
9 romagnani s. biology of human th1 and th2 cells ［j］. j ciln immun, 1995; 15(3):121129.
10 filion l g, grazianibowering g, matusevicius d et al. monocytederived cytokines in multiple sclerosis ［j］. clin exp immunol，2003;131（2）：324334.
11 gbadamosi j, buhmann c, tessmer w et al. effects of mitoxantrone on multiple sclerosis patients’ lymphocyte subpopulations and production of immunoglobulin，tnfalpha and il10 ［j］. eur neurol，2003;49（3）：137141.
12 almeras l, meresse b, seze j et al. interleukin10 promoter polymorphism in multiple sclerosis：association with disease progression ［j］. european cytokine network，2002;13（2）：200206.
13 muhallab s, lidman o, weissert r et al. intracns activation by antigenspecific t lymphocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis ［j］. j neuroimmunol，2001;113(2):202211.
