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脐血CD34+造血干/祖细胞基因表达图谱的研究

2015-07-10 08:43 来源:学术参考网 作者:未知

【摘要】 目的:通过脐血cd34+造血干/祖细胞的基因表达分析,理解造血干/祖细胞生物学特性。方法:利用minimacs免疫磁珠法从脐血细胞中分离cd34+造血干/祖细胞,提取总rna,用smartpcr技术从微量rna中扩增产生足够量的cdna用于高密度点阵膜分析检测cd34+造血干/祖细胞表达的基因。结果:在所检测的588个基因中,发现63个基因具有显著的表达水平,其中18个基因强表达。这些基因主要涉及造血干细胞增殖、分化、应激响应、凋亡、转录调节以及细胞周期等。结论:对理解脐血干/祖细胞生物学性质以及指导造血干细胞体外培养提供了分子生物学基础。

【关键词】 脐血 cd34+造血干/祖细胞 smartpcr 高密度点阵膜

  gene expression analysis of primary human cd34+ hematopoietic stem and progenitor cells from umbilical cord blood

  li qunliang, cai haibo, liu qiwei, tan wensong.

  the state key laboratory of bioreactor engineering, east china university of science and technology, shanghai 200237, china

  [abstract] objective:to better understand biological activities of cd34+ hematopoietic stem and progenitor cells(hspcs) derived from umbilical cord blood(ucb).methods:cd34+ hspcs were collected from fresh ucb by minimacs seperation. smartpcr technology was employed to amplify cdna from isolated rna. hybridization experiments were performed to determine gene expression pattern of cd34+ hspcs using atlas cdna expression array covering 588 genes.results:the data from gene expression analysis revealed that 63 genes were significantly expressed in cd34+ hspcs, and 18 genes were expressed at high levels. these expressed genes involved mainly in proliferation, differentiation, stress responses, apoptosis, transcription regulation, and cell cycle.conclusion:this study gives some new insights into genetic program of hspcs, and it may be helpful to understand biological properties and improve manipulation of hematopoietic cells.

  [key words] umbilical cord blood;cd34+ hematopoietic stem and progenitor cells;smartpcr;cdna array

  造血干细胞具有自我更新和分化成所有血细胞的潜能,对维持造血功能的动态平衡起着至关重要的作用。wWw.133229.coM鉴定造血干/祖细胞的基因表达图谱对认识造血发育和调控具有重要的意义,为改善其临床应用以及指导体外培养提供理论基础。因此研究cd34+造血干/祖细胞的基因表达图谱成了人们探索的热点。可能是由于脐血干细胞数量少的缘故,致使目前只有极少的相关报道。mao等[1]通过大量收集脐血和pcr方法将cd34+造血干/祖细胞表达的基因反转录成cdna克隆到λzapⅱ载体中进行测序,所得到的ests(expressed sequence tags)与公共基因库对比分析,发现855个已知基因表达。这些基因主要涉及造血、细胞分裂、细胞信号、细胞结构、细胞防御反应、基因表达以及代谢等,为造血干细胞或其他干细胞系统的基因表达分析提供了借鉴作用。在此,本实验采用smartpcr技术结合高密度点阵膜分析策略对脐血cd34+造血干/祖细胞的基因表达进行了研究,所得结果对造血干细胞生物学特性的理解具有启示作用。

  1 材料与方法

  1.1 cd34+造血干/祖细胞的分离纯化 采用minimacs免疫磁性吸附柱分离装置和cd34+造血干/祖细胞富集试剂盒(milienyi biotech公司),按说明进行cd34+造血干/祖细胞的分离纯化。为了提高cd34+造血干/祖细胞的纯度,将第一遍收获的cd34+造血干/祖细胞再用一根新的minimacs吸附柱进行第二轮分离纯化,经过两轮分离富集得到的cd34+造血干/祖细胞纯度高达95%以上。

  1.2 总rna提取 用trizol(invitrogen)试剂提取从少量cd34+造血干/祖细胞中提取总rna,采用rq1 rnasefree dnase(promega公司)去除rna样品中混杂的少量dna,所得样品可直接进行反转录或添加rnase抑制剂于-70℃保存。

  1.3 smartpcr扩增cdna 由于rna样品极少,因此采用smartpcr技术扩增生成足够量的cdna用于高密度点阵膜分析。首先,利用smart技术,以rna样品为模板,在反转录酶的作用下合成单链cdna;再经适当pcr循环数扩增后合成足量的双链cdna。smartpcr反应产物经过纯化后检测其含量,便可用于标记杂交探针。

  1.4 探针制备 取500 ng左右的cdna在klenow酶 (takara公司)的作用下,利用α32p datp和clontech公司杂交试剂盒提供的高密度点阵膜特异引物(而不是随机引物)合成杂交探针,特异引物的使用能提高杂交的灵敏度和特异性。探针经nucleospin柱子纯化后,检测其放射性强度。

  1.5 cdna array分析 实验所使用的cdna array购自clontech公司,产品号为77401,含588个基因。首先进行预杂交,然后将纯化的探针加入杂交管中杂交过夜,洗膜后压磷屏显影。扫描磷屏,将所得原始数据以excel表格的形式输出以作进一步分析研究。基因表达强度在背景3倍以上的视为显著表达,10倍以上则为强表达[2,3]。

  2 结果

  2.1 脐血cd34+造血干/祖细胞基因表达图谱 本实验使用的高密度点阵膜所含基因涉及细胞重要的生理功能。从单份脐血中获得4.55×104个cd34+造血干/祖细胞,抽提总rna,采用smartpcr技术经过21个循环之后扩增得到足够量的cdna用于高密度点阵膜分析,基因表达图谱见图1。该点阵膜被分为6个功能基因区域,用a、b、c、d、e和f表示,每一区域由14行7列,即98个基因组成,每个基因由两个点对应。高密度点阵膜的最下方一行为对照点,由空白点、阴性对照和阳性对照组成。实验表明smartpcr技术能从少量的细胞中扩增cdna用于高密度点阵膜分析,是探索干细胞分子生物学的一种有效工具。

  2.2 脐血cd34+造血干/祖细胞表达的基因 实验结果表明在所检测的588个基因中,63个基因在脐血cd34+造血干/祖细胞中显著表达,18个基因强表达。这些表达的基因主要涉及细胞受体、细胞信号、应激响应、胞内信号转导、转录调节、细胞周期、癌基因和肿瘤抑制因子以及细胞凋亡等,见表1。 细胞受体包括细胞因子受体(ifngr2和il2rα)、神经细胞特有的表面受体(nmbr和epha1)以及造血细胞归巢相关的细胞表面分子(cd11a和flt1)等,其中il2rα、epha1和cd11a强表达。与细胞信号相关的基因主要编码细胞因子、生长因子以及趋化因子,它们是il10、mcsf、il1β、dbi、calgranulin a、tmsb10、tdgf3、pdgfα、tgfβ1、ccl3、ccl4以及ccl5等,而calgranulin a、tmsb10、ccl3和ccl5表达水平高出背景10倍以上。应激响应相关的基因包括抗氧化(gpx1、prdx1、gst1、prdx2、sod1以及gstm1)、耐热(hsp25和hsp90)以及dna损伤修复(ercc1,mlh1)等,gst1、hsp25、hsp90和mlh1高表达。与细胞凋亡有关的基因编码产物是caspase蛋白,包括caspase3、caspase8和caspase10等,其中caspase8强表达。 4个细胞周期相关基因是p16、p21、cyclinb1和foxo1a,其中p16、p21和foxo1a抑制细胞分裂,而cyclinb1却有促进细胞分裂的作用。另外还包括8个胞内信号转导蛋白基因、15个转录调节基因以及3个癌基因和肿瘤抑制因子基因等。

  图1 脐血cd34+造血干/祖细胞基因表达图谱(略)

  fig.1 gene expression pattern of primary cd34+ hspcs from ucb

  3 讨论

  通过基因表达分析发现63个基因显著表达,这些表达的基因与mao等研究的结果相似,主要涉及造血调节、细胞信号、细胞周期、转录调节以及细胞抵抗协迫环境等,进一步证实了本实验结果的正确性, 有助于加深对造血干细胞生物学性质的理解。

  在表达的细胞受体中除了造血细胞归巢相关的细胞表面分子(cd11a和flt1)外,还包括神经细胞特有受体(nmbr和epha1)等。脐血干/祖细胞表达神经细胞受体说明在造血的早期阶段存在神经细胞和造血细胞发育的作用机制共同调节造血细胞生长的可能性,并且从分子水平支持了体外培养的造血干细胞能向神经细胞分化的观点[4]。整合素分子cd11a是组成白细胞功能抗原(lfa1)的一个亚基,lfa1与细胞间黏附分子(icam1)相互作用对造血干细胞归巢起着重要作用[5]。细胞受体flt1已被证实表达在骨髓cd34+造血干/祖细胞表面,参与造血细胞的迁移,对造血干细胞归巢具有招募作用;还可作为酪氨酸激酶受体,调节造血干细胞的增殖与分化[6]。在此,我们也发现该受体表达在脐血cd34+造血干/祖细胞表面,进一步表明了flt1分子对造血干/祖细胞生物学活性调节的普遍性。因此,系统而全面地检测造血干细胞表达的黏附分子并鉴定其在迁移和归巢过程中所起的作用有助于认识造血干细胞归巢特性的分子基础。

  表1 脐血cd34+造血干/祖细胞表达的基因(略)

  tab.1 genes expressed in primary cd34+ hspcs from ucb

  note:1) the genes with expression levels of more than 10 folds over background are indicated by symbol.

  另外,cd34+造血干/祖细胞表达许多与其增殖和分化调节相关的细胞因子、生长因子、趋化因子及其受体等,这表明在体内造血干细胞的生长行为除了受到来自基质细胞和分化成熟细胞以旁分泌方式所产生的细胞因子等的刺激作用外,还可能存在造血干细胞自分泌的调节方式。janowskawieczorek等[7]指出越来越多的证据表明自分泌和旁分泌机制协同作用控制细胞因子等的表达和分泌,进而有效地调节造血过程的动态平衡。理解正常和病理状态下造血干细胞增殖和分化的调控因素(包括细胞因子等)将对白血病的治疗以及开发更加有效的造血干/祖细胞扩增策略提供借鉴。

  值得注意的是,脐血cd34+造血干/祖细胞表达多个与应激响应相关的基因,提示造血干/祖细胞很可能具有较强的抵抗不利生长环境的特性,这与最近的研究报道相一致。ramalhosantos等[8]通过比较胚胎干细胞、神经干细胞以及造血干细胞的基因表达图谱,发现216个基因共同表达在这三类干细胞系统中,这些表达基因可能代表了干细胞的属性(stemness)。进一步分析表明许多基因涉及到干细胞的应激响应,表现在dna损伤修复、蛋白质折叠、泛素系统以及脱毒机制等。这种独特的应激响应机制可能赋予了干细胞较强的环境适应能力。

  总之,造血干/祖细胞的基因表达分析有助于理解造血干细胞的生物学特性,为造血干细胞的临床应用以及体外培养操作提供科学依据。

【参考文献】
  1 mao m, fu g, wu j s et al. identification of genes expressed in human cd34+ hematopoietic stem/progenitor cells by expressed sequence tags and efficient fulllength cdna cloning [j]. proc natl acad sci usa, 1998;95(14):81758180.

  2 terskikh a v, miyamoto t, chang c et al. gene expression analysis of purified hematopoietic stem cells and committed progenitors [j]. blood,2003;102(2):94101.

  3 lu s j, li f, vida l et al. cd34+cd38- hematopoietic precursors derived from human embryonic stem cells exhibit an embryonic gene expression pattern [j]. blood, 2004; 103(11):41344141.

  4 steidl u, bork s, schaub s et al. primary human cd34+ hematopoietic stem and progenitor cells express functionally active receptors of neuromediators [j]. blood, 2004;104(1):8188.

  5 berrios v m, dooner g j, nowakowski g et al. the molecular basis for the cytokineinduced defect in homing and engraftment of hematopoietic stem cells [j]. exp hematol, 2001;29(11):13261335.

  6 hattori k, heissig b, wu y et al. placental growth factor reconstitutes hematopoiesis by recruiting vegfr1(+) stem cells from bonemarrow microenvironment [j]. nat med, 2002;8(8):841849.

  7 janowskawieczorek a, majka m, ratajczak j et al. autocrine/paracrine mechanisms in human hematopoiesis [j]. stem cells,2001;19(2):99107.

  8 ramalhosantos m, yoon s, matsuzaki y et al.“stemness”: transcriptional profiling of embryonic and adult stem cells [j]. science, 2002; 298(5593):597600.

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