【摘要】目的研究人脐带血间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能及其移植后对糖尿病大鼠的治疗效果。方法体外分离培养HUCB-MSCs, 在胰岛细胞培养条件下经药物定向诱导其分化；免疫组化对诱导细胞进行胰岛β细胞标记鉴定；双硫腙染色鉴定锌离子表达及检测胰岛样细胞的移植效果。结果HUCB-MSCs经诱导后, 免疫细胞化学染色显示表达人胰岛素；双硫腙染色呈棕红色；移植后2周, 胰岛样细胞组血糖浓度明显降低。结论HUCB-MSCs在体外诱导培养条件下, 具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能, 这种细胞可能为Ⅰ型糖尿病提供一条新的治疗途径。
【关键词】人脐带血；间充质干细胞；定向诱导；糖尿病
Inducing human umbilical cord blood mesenchymal stem cells into insulin secreting cells in vitro culture and its effects on diabetes rats WANG Ying, LUO Hao-hong, GAO Hong-quan, et al. Medical College of Xiamen, Xiamen 361008, China
【Abstract】ObjectiveTo explore the possibility of inducing the differentiation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells(HUCB-MSCs) into insulin secreting cells in vitro and the therapeutic efficacy on diabetic rats following transplantation. Methods We isolated and cultured HUCB-MSCs, and induced HUCB-MSCs to differentiate into insulin secreting cells in the islet cell culture condition. HUCB-MSCs of induction were detected by immunocytochemical Methods. Zinchydronium was detected by Dithizon staining. Transplantation efficiency of islet-like cells was detected. Results Under induction, immunocytochemical examination showed that the expression of human insulin was positive. Dithizon stain showed that the cytoplasm of HUCB-MSCs was stained in brownish red color after induction. At 2 weeks following transplantation, blood glucose concentration in the islet-like cell group significantly reduced. Conclusion HUCB-MSCs can be differentiated into insulin secreting cells in vitro. HUCB-MSCs have the potential to become an excellent candidate in β cell replacement therapy of typeⅠdiabetes.
【Key words】Human umbilical cord blood; Mesenchymal stem cells; Induction; Diabetes rats2000年, Erices等［1］报道人脐血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cell/ mesenchymal progenitor cell, MSC/MPC)。脐带血间充质干细胞(umbilical cord blood mesenchymal stem cells, UCB-MSCs)为中胚层发育的早期细胞, 具有多向分化的潜在能力, 其形态和生物学特点与骨髓来源 MSCs 相似［2］。UCB-MSCs具备自我更新和增殖的能力, 并具备多向分化潜能特性。在一定条件下进行体外培养和诱导分化后具有向神经细胞(神经元和神经胶质细胞)、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和心肌细胞等方向分化功能, 可作为细胞治疗的种子细胞和基因治疗的载体细胞［3-5］。脐血又具有淋巴细胞抗原性弱、功能相对不成熟、移植后发生移植物抗宿主病的风险较低等特点, 与其他类型的干细胞比较, 取材方便, 扩增数大, 来源广泛, 不受伦理和道德的限制, 因此脐血干细胞将以其自身的特性和优势占据重要的位置, 具有重大的理论意义和潜在的临床应用价值［6］。
1试剂与方法
1. 1试剂DMEM培养基(美国Gibco公司)；优质胎牛血清(杭州四季青公司)；重组碱性成纤维生长因子(basic fibroblastgrowth factors, bFGF)、重组表皮生长因子(epidermisgrowth factors, EGF)、β-细胞调节素(PeproTech公司)；β-巯基乙醇(上海试剂四厂)；尼克酰胺、ITS、双硫腙、B27(GBICO公司)；荧光标记小鼠抗人抗体CD49d、CD34(Bioscience美国)；小鼠抗人胰岛素单克隆抗体 (Neomarkers公司)。
1. 2HUCB-MSCs表面标记检测取第4代的HUCB-MSCs, 经消化后离心, 调节细胞浓度为1×105/ml, 接种有盖玻片的6孔板内培养, 当细胞生长到融合状态时, 取出盖玻片, 再按照试剂盒说明进行免疫细胞化学染色, 实验组分别滴加50 μl一抗小鼠抗人抗体CD49d、CD34于盖玻片上, 然后按照常规细胞化学染色方法进行操作。空白对照组用PBS代替一抗。倒置显微镜下观察拍照。
1. 3体外诱导后胰岛细胞检测
1. 3. 1双硫腙的染色诱导方法参考［7］。6孔培养板中将诱导约12 d及未诱导的细胞, PBS洗2遍, 然后每个孔分别加入1 ml PBS和10 μl双硫腙储存液, 充分混匀, 置37℃孵育20 min后, PBS洗3次, 倒置显微镜观察并拍照。
1. 3. 2免疫细胞化学染色将诱导12 d的细胞进行常规免疫细胞化学染色, 用小鼠抗人胰岛素单克隆抗体作为一抗, 参照免疫组化试剂盒说明书进行操作, DAB染色、脱水、透明、封片, 光学显微镜下观察并拍照。对照组用PBS代替一抗。采用图像分析仪进行结果分析。选取10个高倍镜的视野计数细胞总数以及阳性细胞数, 计算诱导率。诱导率＝阳性细胞/细胞总数×100%。
1. 3. 3统计学方法采用SPSS11.5软件处理数据, 计量资料以均数±标准差( x-±s)来表示, 进行t检验, P<0.05表示差异具有统计学意义。
1. 4胰岛样细胞移植造模糖尿病大鼠
1. 4. 1大鼠糖尿病模型的制备［8］将12只SD大鼠随机分为实验组8只和对照组4只。实验组大鼠空腹12 h后, 经腹腔注射70 mg/kg链脲佐菌素(以0.1 mol/L枸橼酸缓冲液溶解), 对照组腹腔注射等体积的生理盐水。两组大鼠注射后2 d, 4 d, 6 d从尾静脉采血检测空腹血糖, 选连续3次血糖浓度高于16.7 mmol/L(正常值为2.80~7.56 mmol/L)的大鼠作为糖尿病模型。
1. 4. 2胰岛样细胞团的移植8只实验组分为4只胰岛样细胞组, 4只模型对照组。取2×106个的第4~8代HUCB-MSCs用900 μl PBS重悬细胞, 吸入1 ml注射器内经尾静脉注入糖尿病鼠体内。模型对照组注入等体积的生理盐水。各组大鼠均于移植前及移植后2 d检测空腹血糖浓度, 以后每周定点检测空腹血糖1次。
2结果
2. 1贴壁细胞鉴定对第4代贴壁细胞通过免疫细胞化学染
色, 结果显示贴壁的细胞CD49d表达阳性, 细胞质呈棕黄色(见图1)；而CD34表达阴性, 大部分细胞质未着色, 细胞核为蓝色(见图2)。说明贴壁细胞为HUCB-MSCs。
2. 2诱导胰岛细胞的检测
2. 2. 1胰岛细胞双硫腙(DTZ)染色结果实验组细胞在DTZ染色的过程中, 多数细胞由贴壁状态变成悬浮细胞, 只有少数细胞保持贴壁状态。DTZ是铅试剂, 与胰岛β细胞内丰富的锌离子结合染成了棕红色。在倒置显微镜下观察, 经DTZ染色显示多数细胞为棕红色(见图3)。对照组的细胞DTZ染色不着色。
2. 2. 2免疫细胞化学染色在高糖等诱导环境下, UCB-MSCs聚集成为细胞团, 实验组细胞可观察到特异性的胰岛素表达, 阳性细胞质表现为棕褐色(见图4)。说明细胞质中有胰岛素分泌, 细胞核淡黄色。对照组细胞质染色呈阴性, 不含胰岛素。实验组以及对照组的诱导分化阳性率及灰度值见表1, 表2, 图5, 图6。
表112 d兔抗人胰岛素抗体检测结果( x-±s, ％)
组别 n 诱导率
实验组 8 23.75±3.59a
对照组 4 1.52±0.89
注：两组比较, a P<0.05
图512 d诱导细胞兔抗人胰岛素抗体表达柱形图
表212 d图像分析系统灰度值测定结果( x-±s)
(背景染色：183.3674±3.2865)
组别 兔抗人胰岛素抗体
实验组 112.68±5.41a
对照组 184.14±1.24
注：两组比较, a P<0.05
图612 d兔抗人胰岛素抗体免疫细胞化学结果灰度值比较
2. 3胰岛样细胞团移植效果检测血糖浓度正常的大鼠经腹腔注射链脲菌素2 d后, 大鼠血糖的浓度迅速升高；4 d、6 d后大鼠血糖浓度均高于16.7 mmol/L。胰岛样细胞移植后2周, 胰岛样细胞组大鼠血糖浓度明显降低, 模型对照组血糖浓度一直处于糖尿病血糖浓度范围内(见表3)。
表3胰岛样细胞移植后不同时间点大鼠空腹
血糖浓度的变化( x-±s, n=3, mmol/L)
组别 n 2周 4周 6周
胰岛样细胞组 4 23.57±5.23a 18.67±4.51a 16.42±1.42
模型对照组 4 25.36±3.35 25.36±3.35 24.52±8.72
注：aP<0.05, 组间比较差异具有统计学意义
3讨论
间充质干细胞来源于胚胎发育期的中胚层, 是间充质细胞起源于微环境中的一类多能性前体细胞。近年来UCB-MSCs作为一种同质细胞群, 已经被众多实验室成功分离。UCB-MSCs不仅在适当的诱导条件下可向外胚层、中胚层、内胚层分化, 而且还有向伤处迁移的能力, 是基础研究实验材料的理想细胞和基因治疗的载体。本实验通过免疫细胞化学染色检测分离培养的细胞表面标记CD49d阳性表达, CD34阴性表达, 由此证明培养的细胞为HUCB-MSCs。
间充质干细胞诱导分化胰岛β细胞的诱导因素包括两类：一类为启动胰岛β细胞特异性转录因子的生物因子, 如bFGF、肝细胞生长因子、尼克酰胺等；另一类为诱导 nestin 蛋白的表达, 如β-巯基乙醇、DMSO 等［9］。本实验诱导方案分为三个阶段, 第一、二阶段HUCB-MSCs形态未见明显变化, 细胞数量增长速度有所减慢;第三阶段相邻细胞发生明显的形态变化, 开始逐渐变圆并聚集成胰岛样细胞团, 这些细胞团呈类圆形, 大小不等。诱导后的细胞, 经DTZ染色胰岛细胞染成棕红色, 经胰岛素免疫荧光染色检测, 呈阳性反应, 而对照组则没有着色。说明HUCB-MSCs 经诱导后得到了胰岛素分泌细胞。胰岛样细胞经糖尿病大鼠尾静脉移植入体内2周后, 糖尿病大鼠空腹血糖浓度明显下降, 说明胰岛样细胞分泌的胰岛素迅速发挥了降血糖的作用, 胰岛样细胞移植可以治疗糖尿病。这种HUCB-MSCs移植入糖尿病大鼠体内发挥降血糖作用的优化条件和维持时间将成为今后研究的重点。
参考文献
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