【摘要】 目的：观察il12和il18基因免疫对hbcag核酸疫苗诱导小鼠(h2d)特异性体液免疫和细胞免疫应答的影响。方法：用肌肉注射法将hbv核心区dna疫苗、il12质粒和il18 质粒接种balb/c小鼠；elisa法检测小鼠血清抗hbc(igg)及igg亚类(igg1、igg2a)；ldh释放法检测小鼠脾细胞hbcag特异性ctl活性。结果：免疫6周后，hbcag dna疫苗联合il12质粒、il18质粒和il12+il18质粒组小鼠的血清抗hbc终点滴度均明显高于单纯注射hbcag dna疫苗组小鼠（p<0.05），抗hbc igg亚类以igg2a占优。dna疫苗免疫的各组小鼠，hbcag特异性细胞毒性t淋巴细胞杀伤率均高于对照组(p组)，其中c+il18组和c+il12+il18组中ctl值明显高于c组，尤以c+il12+il18组中的ctl杀伤率最高。结论：il12和il18基因与hbcag dna疫苗联合免疫，不仅能增强hbcag特异性体液免疫应答，而且能增强hbcag特异性ctl的杀伤活性。
【关键词】 乙型肝炎核心抗原 dna疫苗 小鼠 il12 il18
the effects of il12 and il18 genetic immunizations on humoral and cellular immune responses in h2d mice induced by dna vaccination of hbv core gene
wu xin, huang zuhu,cheng jun, xing yiping,dong jing.
the no.16 institute of infectious diseases,the 302 hospital of pla, beijing 100039, china
［abstract］ objective:to observe the humoral and celluar immune responses to gene vaccines coding hbv core gene, il12 and il18 in balb/c(h2d) mice.methods:the dna vaccine of hbv core antigen,expressing plasmids of il12 and il18 were immunized intramuscularly injection in balb/c mice.the levels of antihbc(igg) and its isotypes(igg1,igg2a) were detected by elisa methods.hbcag specific cytotoxic t lymphocyte(ctl) activity was measured by ldh release assay.results:six weeks after the 1st immunization,the levels of antihbc in groups of mice immunized with dna vaccine of hbv core plus il12 or il18 or both il12 and il18 were all much higher than that in group of mice immunized with hbv core dna vaccine alone(p<0.05). the levels of igg isotype of igg2a were generally higher than igg1 in all groups of mice immunized with dna vaccines mentioned above. by comparing with group p, hbcag specific cytotoxicity t lymphocytes in group c, c+il12, c+il18 and c+il12+il18 increased, and ctl in group c+il18 and c+il12+il18 increased more significantly than group c, especially in c+il12+il18.conclusion:the results in this study show that codelivering il12 and il18 gene with hbcag dna vaccine could enhanced humoral and cellular immune responses.
［key words］ core antigen hepatitis b virus；dna vaccine；mouse；il12；il18
在乙型肝炎病毒（hbv）感染慢性化进程中，th1/th2细胞因子的分泌紊乱，特别是th1类型细胞因子产生缺陷，导致针对hbv的细胞免疫功能以及辅佐b细胞功能低下，病毒不易被清除。www.133229.coM
dna疫苗是近年来发展起来的一种免疫方法，它是将编码特异性抗原的基因表达载体直接导入机体以激发机体产生特异性免疫应答。dna疫苗可以被体细胞摄取并表达相应抗原，进而激发起保护性免疫应答，包括特异性细胞毒性t淋巴细胞（ctl）应答及特异性抗体的产生。
il12和il18均属于th1型细胞因子，具有许多类似的生物学活性，在诱导ifnγ生成和th1型免疫应答方面，两者相互协同。本研究采用以哺乳动物高表达质粒(pjw4303)为载体的乙肝核心抗原（hbcag）dna疫苗，以小鼠(h2d)为实验动物，观察il12和il18基因免疫对hbcag dna疫苗诱导小鼠特异性体液免疫和细胞免疫应答的影响。
1 材料与方法
1.1 核酸疫苗及质粒dna的提取 hbv核酸疫苗pjw4303/hbc由本实验室自行构建，已证实可高效表达hbcag［1］。pcdna3.1/il12和pcdna3.1/il18 dna疫苗（以下简称il12和il18）由解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心成军教授惠赠，已证明可高效表达il12和il18［2，3］。对照质粒pjw4303由美国马萨诸塞大学robinson教授提供。p815细胞系本室自备。采用qiagen plasmid purification(mega) kit(giagen inc.,germany)。每1 000 ml hb101转化株菌液可获高纯度质粒约2～4 mg。
1.2 小鼠来源、分组及血清标本采集 6～8周龄雌性balb/c(h2d)小鼠由上海动物实验中心提供。共设5组，每组6只小鼠，剪耳法编号。组别为pjw4303组（p组）、pjw4303/hbc组（c组）、pjw4303/hbc+il12质粒组（c+il12质粒组）、pjw4303/hbc+ il18质粒组（c+il18质粒组）及pjw4303/hbc+ il12质粒+il18质粒组（c+il12+il18质粒组）。采用毛细吸管眼内眦静脉采血法采集小鼠血清，-70℃冻存。
1.3 免疫方法 将提取的质粒用无菌生理盐水稀释，p组（对照组）注射pjw4303空载质粒100 μg，c组注射pjw4303/hbc质粒100 μg，c+il12质粒组注射pjw4303/hbc和il12质粒各100 μg，c+il18质粒组注射pjw4303/hbc和il18质粒各100 μg，c+il12+il18质粒组注射pjw4303/hbc、il12和il18质粒各100 μg，每次注射于小鼠两后肢股四头肌内，100 μl/只。于第0、2、4周免疫小鼠，每次免疫前取血，第6周再取血。
1.4 hbcag特异性抗体（抗hbc igg）及igg亚类（igg1、igg2a）检测
1.4.1 抗hbc igg检测 以重组hbcag（购自南京生工服务公司）1∶200稀释，100 μl/孔包被96孔elisa板。待测血清（各组单个小鼠血清）作系列3倍稀释(1∶150、1∶450、1∶1 350……1∶26 572 050)。以生物素化羊抗鼠igg和亲和素偶联hrp（北京中山生物有限公司）1∶5 000稀释检测小鼠血清中抗hbc终点滴度，取p/n>2.1时的最高血清稀释度为终点滴度。
1.4.2 抗hbc igg亚类检测 包被elisa板同上，待测血清（各组第6周单个小鼠血清）以1∶100稀释，以1∶500稀释的hrp标记的羊抗鼠igg1或igg2a（southern biotechnology associates，inc.）为第二抗体，采用间接elisa法检测各组单个小鼠血清抗hbc igg1、igg2a水平，并根据a450值计算igg2a/igg1比值。
1.5 免疫小鼠脾细胞特异性ctl检测 采用pregma公司的ldh细胞毒性检测试剂盒检测免疫小鼠脾细胞特异性ctl，按其说明书操作规程进行操作，简述如下。小鼠经末次免疫后4周(即第12周)时，在麻醉状态、无菌条件下取小鼠脾脏，制成单个脾细胞悬液。小鼠脾细胞用hbcag特异性ctl表位多肽(h2d限制性多肽为syvntnmgl)作刺激培养(37℃、6天)，多肽终浓度为10 μg/ml。效应细胞∶靶细胞范围为40∶1～2.5∶1。ctl杀伤率按以下公式计算。
ctl杀伤率(%)=（实验组a值-效应细胞自发性释放a值-靶细胞自发性释放a值）/靶细胞最大释放a值-靶细胞自发性释放a值）×100%。
1.6 统计学处理 采用spss 10.0统计软件处理，采用方差分析中的最小显著差法（lsd法）检验，抗体滴度取对数。
2 结果
2.1 各组小鼠血清抗hbc滴度的动态变化 本研究中p组抗hbc滴度0、2、4、6周均在1∶150，c组小鼠第6周抗hbc滴度最高达1∶109 350。c+il12组小鼠抗hbc虽在第4周才检测到，但至6周，其抗hbc滴度均达到1∶109 350以上，个别小鼠达到了1∶984 150；c+il18组小鼠，第2周就已有2只产生抗hbc，且随着时间的延长，滴度不断增加，至第6周有4只小鼠抗体滴度超过1∶109 350，1号小鼠滴度达到了1∶984 150；c+il12+il18组小鼠在第4周也产生抗hbc，至第6周时小鼠抗hbc滴度基本均在1∶109 350以上（注：表1中c+il12质粒组因为6号小鼠在免疫前抗hbc已阳性，故未将其计算在内）。
2.2 各组单个小鼠血清第6周抗hbc终点滴度的比较c+il12质粒组、c+il18质粒和c+il12+il18质粒组中各小鼠血清抗hbc的滴度均较高，基本上都在1∶109 350以上，c组小鼠血清抗hbc的滴度最高才达到1∶109 350，且有50%小鼠抗hbc的滴度较低。
采用方差分析中的最小显著差法（lsd法）检验对第6周时各组小鼠血清抗hbc的终点滴度进行了统计，c+il12质粒组、c+il18质粒组及c+il12+il18质粒组与c组差异有显著性（p<0.05），但c+il12质粒组、c+il18质粒组及c+il12+il18质粒组各组间无差异。
表1 各组小鼠抗hbc终点滴度的动态变化及抗hbc igg亚类比值（略）
tab.1 the levels of antihbc(igg) kinetics and the amount of igg2a/igg1 in all group
图1 各组单个小鼠血清第6周抗hbc igg2a亚类igg1亚类均值（略）
fig.1 the average antihbc subtype antibody titers(-log10)(igg2a and igg1) in all group at 6 week
note:a.igg2a;b.igg1.
图2 第12周各组小鼠脾细胞hbcag特异性ctl杀伤活性（略）
fig.2 hbcag specific ctl activity in all group at 12 week
2.3 各组小鼠血清抗hbc igg亚类比值（igg2a/igg1） 各组小鼠抗hbc igg2a/igg1比值均大于1，提示以igg2a为主。采用t检测比较各组小鼠血清平均igg2a/igg1比值，显示各组之间无明显差异（p>0.05），见表1。
各组小鼠中抗hbc igg2a亚类均占优，其中c+il12质粒组中抗hbc ig2a亚类增加最为显著。采用方差分析中的最小显著差法（lsd法）检验，在促进抗hbc igg2a亚类生成方面，c+il12质粒组与c组及c+il18质粒组差异有显著性（p<0.05，p=0.001），与c+il12+il18质粒组无差异；在促进抗hbc igg1亚类生成方面，各组无差异，见图1。
2.4 免疫小鼠脾细胞hbcag特异性ctl检测结果 注射空载质粒的p组没有观察到有hbcag特异性ctl活性；c组产生了较低水平的hbcag特异性ctl活性，e∶t为40∶1时杀伤率为13.2%；c+il12组产生的hbcag特异性ctl活性与c组相近，在e∶t为40∶1时，杀伤率为17.2%；联合注射il18基因的c+il18组在e∶t为40∶1时，杀伤率为36.7%；联合注射il12+il18基因的c+il12+il18组小鼠所产生的特异性ctl杀伤活性最强，在e∶t为40∶1时，杀伤率达到67.5%，与其他各组相比，差异具有显著性（p<0.01），见图2。
3 讨论
多特异性的cd8+t细胞反应能通过溶细胞或非溶细胞的机制来清除感染hbv的靶细胞。可是，cd8+t细胞的生成和维持需要有效的抗原提呈和cd4+t细胞辅助［4］。越来越多的证据表明，强烈的、以th1表型占优的病毒特异性的cd4+t细胞反应是有效维持ctl反应的重要组分之一［5］。而要使cd4+t细胞反应倾向于th1型，必须在适宜的细胞因子环境中进行有效的抗原提呈，在这一过程中，il12已被确认是一关键性的细胞因子［5］。
ifnγ与细胞免疫应答的形成紧密相关。已证实ifnγ可作用于cd4+t细胞，促进th1细胞形成，抑制th2细胞形成；ifnγ还可促进cd8+t细胞发育成熟为细胞毒性t细胞(tc)。cavanaugh等［6］在hbv转基因小鼠模型中，证实il12可能为ifnγ的协同刺激分子，il12的抗病毒作用主要是通过其诱导产生ifnγ的能力而起作用的。在分枝杆菌、伤寒杆菌等胞内细菌感染的疾病中证实，il18所产生的保护性作用主要也是由ifnγ介导的［7］。
il12又称ctl成熟因子和nk细胞刺激因子。在本研究中，c+il12组小鼠的hbcag特异性ctl杀伤率在e∶t为40∶1时仅达17.2%，其增强作用似乎不明显。il12诱导ifnγ生成是与capase1介导的il18分泌相关的。在il18表达缺陷鼠中，尽管有足量的il12存在，生成ifnγ和ctl量仍然明显地下降。同时，使用中和性抗il18抗体可抑制il12诱导小鼠脾细胞生成ifnγ。总之，在小鼠和人脾细胞中，il12就是达到纳摩尔浓度也不能诱生ifnγ［8］。因此，本实验中c+il12组虽然生成了足量的il12，但由于未能诱生出足量的ifnγ，不能对ctl杀伤率产生明显的增强的作用。chow等［9］将il12基因与hbsag dna疫苗联合注射，发现il12增强了hbsag特异性ctl活性。我们的结果与之不同，可能是由于抗原提呈方式不同所引起的，因为hbcag的初次免疫应答在体内主要是由b细胞呈递的，而大小相似且同样具有颗粒结构的hbsag却无此特性。
诱导t细胞和nk细胞产生ifnγ是il18最重要的生物学功能之一。il18可诱导nk细胞产生早期的ifnγ应答，介导先天性免疫应答；诱导t细胞产生晚期的ifnγ应答，介导过继性免疫应答。robinson等［10］认为在没有il12存在时，仅有il18可使th1反应形成。他们对t细胞进行再次刺激时，加入il18证实，无il12存在时，也能形成th1反应，而且il18诱导th1反应形成是通过诱生ifnγ实现的。由于balb/c鼠系能大量生成il4，所以这些小鼠易于形成针对各种抗原的th2反应。在本实验中，我们将il18基因与hbcag dna疫苗联合注射，发现其增强了hbcag特异性ctl活性，在e∶t为40∶1时其值达33.6%，由于小鼠例数较少，统计学方面差异没有显著性，但il18基因增强hbcag dna疫苗诱导的细胞免疫作用是存在的。其原因可能是c+il18组由于生成了大量il18，诱生ifnγ，促使th1反应形成，从而对ctl杀伤率产生了增强效应。billaut等［11］的结果也证实了这一点。他们将编码hiv1 gag、tat和nef蛋白的混合dna疫苗与编码il18的dna疫苗联合注射，发现联合注射il18基因使ctl诱导时间缩短了2周，il2和ifnγ分泌增加。
il12通过增强il18rα基因表达和细胞表面表达（surface express），可增强细胞对il18的应答。在il12的生成中ifnγ是必需的，il12又可诱导ifnγ生成，这是一个正反馈环。因此，il18通过诱生ifnγ，增强il12诱生th1反应的作用［10］。因而il12和il18常具有协同作用。本研究中c+il12+il18组表现出很强的hbcag特异性ctl杀伤活性，强烈提示il12与il18的协同作用在促进ctl应答中具有重要意义。最近已有学者报道了类似的发现。hanlon等［12］将编码il12的质粒、编码il12和il18的质粒与猫白血病病毒（felv）dna疫苗，肌内注射小猫3次；末次免疫后3周，腹腔内接种felva。结果发现，与含il12和il18质粒联合注射的felv dna疫苗产生了显著的保护性免疫应答，此组中6只小猫都未出现一过性和持续性病毒血症感染，其中5只在骨髓中也未发现潜在性病毒感染；而其他组中未能产生如此显著的保护性作用。这一结果表明il12和il18联合应用更有利于th1反应形成，促进了细胞免疫，从而控制了felv感染。在本实验中，由于il12增强了nk细胞和t细胞等免疫细胞对il18的应答，使il18诱生ifnγ的能力增强，产生了足量的ifnγ，启动il12生成的正反馈环，致使ifnγ升高，后者又促使il12生成增加，反过来又促进il18生成ifnγ的能力，最后导致ifnγ进一步增加，促进cd8+t细胞发育成熟为ctl，从而产生增强效应。
我们在实验中发现联合il12和il18质粒的各组小鼠抗hbc滴度均较单注射hbcag dna疫苗组高，表明联合使用il12和il18不仅对细胞免疫应答产生增强作用，而且对体液免疫应答也产生了增强效应。
在人细胞和小鼠体内，il12能对b细胞产生多种生物学效应，如在抗原特异性免疫应答期间，对大多数同种型抗体的生成产生了增强效应，并改变igg亚类的分布［13］。il12刺激t细胞和nk细胞生成ifnγ，从而促进igg1向igg2a的转化，并对igg1的生成有一过性抑制作用。其后，il12刺激已转化的细胞以非ifnγ依赖方式生成大量的、不同的同种型抗体［13］。因此在本研究中c+il12质粒组在促进抗hbcigg2a形成方面，与c组及c+il18质粒组出现显著差异。chow等［9］研究也证实小鼠联合接种hbsag dna疫苗和il12质粒，能明显抗hbsigg2a的产生。
il18是做为诱导th1细胞生成ifnγ的因子而被发现的。然而，最近的研究却表明在无il12辅助时，il18诱导t细胞、nk细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞生成il4和il13。因此，il18能刺激先天性免疫以及th1和th2介导免疫应答的形成［14］。il18是通过il4依赖性方式诱导th2细胞生成［15］。原初cd4+t细胞与il2和il18联合培养4天，即使在没有抗原刺激时，也可生成适量的il4，用抗原刺激时可明显增强il4的生成［15］。因此，本研究中联合注射il18组中抗hbc抗体滴度也出现了增高。虽然我们研究发现联合注射il18基因可使抗hbc抗体的产生提前2周，但在第6周检测结果中，c+il12组、c+il18组及c+il12+il18组3组之间无统计学差异。
用抗cd40和il4刺激b细胞，可使其生成igg1和ige。联用il12和il18可诱导经抗cd40抗体活化的、高纯度的小鼠b细胞生成ifnγ，抑制il4依赖性ige和igg1的生成，使igg2a生成量增加，对b细胞增生反应却没有产生抑制作用［16］。我们的研究也发现了类似的结果。
在抗原特异性igg中，igg亚类特别是igg1和igg2a的含量比值(igg1/igg2a)在一定程度反映了机体辅助性t淋巴细胞的反应类型。igg2a/igg1>1或igg2a/igg1<1分别提示th1或th2反应类型。chow等［9］发现小鼠联合接种hbsag dna疫苗和il12质粒，能明显增加th1细胞的数量。而在本实验中，联合il12和il18却未能对th1反应产生增强作用，这可能是由于hbcag dna疫苗诱导th1反应的作用已较强，因而再联合il12和il18免疫很难表现出增强作用。
【参考文献】
1 黄祖瑚，卢 山，刘 宁 et al. hbcag dna疫苗诱导小鼠（h2b）特异性细胞和体液免疫应答 ［j］.中华传染病杂志, 1999;17(2):104107.
2 成 军，柯享宁，刘 研 et al.小鼠白细胞介素18的cdna克隆及在真核细胞中初步表达的研究 ［j］.中国免疫学杂志, 2000;16(5):252254.
3 成 军，赵 鸿，钟颜伟 et al. 小鼠白细胞介素12融合蛋白编码基因的构建与表达 ［j］. 中国免疫学杂志, 2000;16(1):3336.
4 rige j p,di rosa f,matzinger p. a conditioned dendritic cell can be temporal bridge between a cd4+thelper and a tkiller cell ［j］.nature, 1998;393:474478.
5 scott p.il12:intiation cytokine for cellmediated immunity ［j］. science, 1993; 260:496497.
6 cavanaugh v j, guidotti l g, chisari f v et al. interleukin12 inhibits hepatitis b virus replication in transgenic mice ［j］. j virology, 1997; 71:32363243.
7 garcia v e, uyemura k, sieling p a et al. il18 promotes type 1 cytokine production from nk cells and t cells in human intracellular infection ［j］. j immunology, 1999;162:61146121.
8 takeda k, tsutsui h, yoshimoto t et al. defective nk cell activity and th1 response in il18deficient mice ［j］. immunity, 1998;8:383390.
9 chow y h, chiang b l, lee y l et al. development of th1 and th2 populations and the nature of immune responses to hepatitis b virus dna vaccines can be modulated by codelivery of various cytokine genes ［j］. j immunol, 1998; 160:13201329.
10 robinson d, shibuya k, mui a et al. igif does not drives th1 development but synergizes with il12 for interferonγ production and activates irak and nfκb ［j］. immunity, 1997; 7: 571581.
11 billautmulot o, idziorek t, loyens m et al. modulation of cellular and humoral immune responses to a multipitopic hiv1 dna vaccine by interleukin18 dna immunization/viral protein boost ［j］. vaccine, 2001; 19:28302811.
12 hanlon l, argyle d, bain d et al. feline leukemia virus dna vaccine efficacy is enhanced by coadministration with interleukin12(il12) and il18 expression vectors ［j］. j virol, 2001;75:84248433.
13 irma a, roberta g, giuseppe c et al. the interleukin12 and interleukin12 receptor system in normal and transformed human blymphocytes ［j］.haematologica, 2002;87:434442.
14 nakanishi k, yoshimoto t, tsutsui h et al. interleukin18 regulates both th1 and th2 responses ［j］. annu rev immunol, 2001;19:423474.
15 nakanishi k, yoshimoto t, tsutsui h et al. interleukin18 is a unique cytokine that stimulates both th1 and th2 responses depending on its cytokine milieu ［j］. cytokine growth factor, 2000;12:5372.
16 okamura h, kashiwamura s, tsutsui h et al. regulation of interferongamma production by il12 and il18 ［j］. curr opin immunol, 1998;10:259264.
