【摘要】 目的：观察不同佐剂对hcvdna疫苗效果的影响。方法：雌性balb/c小鼠分别用脂质体ddab/epc和dcchol/dope、montanide isa 720和氢氧化铝为佐剂的hcvdna疫苗免疫3次，elispot法观察脾淋巴细胞受hcv核心、e2、e1/e2、ns3和ns5b蛋白刺激后细胞因子的产生。结果：ddab/epc组产生ifnγ较多，在大部分情况下，显著高于其它组。该组il2的产生也显著高于其它4组。该组il4的产生，在某些情况下也高于其它组。用ns5b刺激，氢氧化铝组il4的产生显著高于其它4组(p<0.05)。裸dna和两种脂质体组ifnγ的产生高于il4，而montanide和氢氧化铝组il4的产生高于ifnγ。结论：在4种佐剂中，ddab/epc效果最好，montanide和氢氧化铝可将dna疫苗th1为主的免疫特性转换为以th2为主。
【关键词】 核酸疫苗 丙型肝炎病毒 免疫佐剂
immunological effects of different adjuvants on hcvdna vaccine
jin bo, richard yanhui wang，cheng liufang, qiu qi, james waikuo shih.
department of digestive diseases, naval general hospital, beijing 100037, china
［abstract］ objective:the immunological effects of hcvdna vaccine with different adjuvants were detected by elispot in mice.methods:female balb/c mice were primed with naked hcvdna, hcvdna encapsulated by liposome ddab/epc or dcchol/dope, hcvdna mixed with montanide isa 720 or aluminum hydroxide, respectively, and boosted twice accordingly in a fourweek interval. cytokine production by splenocytes was assessed by elispot.results:in most cases, splenocytes from mice vaccinated with ddab/epc liposome produced more ifnγ. these splenocytes also have significant higher il2 production compared with the other groups. in expansion with ns5b, splenocytes from alum group have significance in il4 production compared with other groups. the profile of cytokine production revealed that the infγ overwhelmed il4 in naked dna, ddab/epc, and dcchol/dope groups while il4 surmounted ifnγ in alum and montanide groups.conclusion:encapsulation with liposome ddab/epc has the strongest adjuvant effect in inducing th1 dominated immunity. alum and montanide can convert the th1 nature of dna vaccine to th2biased immunity.
［key words］ dna vaccines；hepatitis c virus(hcv)；immunologic adjuvants
丙型肝炎病毒(hepatitis c virus, hcv)感染是一个严重的全球性健康问题。www.133229.cOm据世界卫生组织在1999年的调查结果表明，全世界有大约一亿七千万人感染丙型肝炎病毒，占全世界人口总数的3%［1］。
在丙型肝炎病毒感染后，虽然机体可以产生很强的体液免疫反应，但仍有75%～85%的急性丙型肝炎病毒感染者不能清除病毒而成为慢性感染者。抗hcv的中和抗体虽然在一定情况下有助于病毒的清除, 但由于丙型肝炎病毒在患者体内可以不断发生演变，从而产生对中和性抗体有抗性的突变株。
因此, 虽然有hcv的中和抗体存在，但细胞免疫反应在防止和清除hcv感染过程中显得更为重要。因此，诱导产生针对hcv的特异性细胞免疫反应就不可避免地成为hcv疫苗研究的重点［2］。
dna疫苗可诱导以i型辅助性t细胞(t helper cell type ⅰ, th1)介导的细胞免疫。为观察不同类型免疫佐剂对hcvdna疫苗免疫效果的影响，我们比较了小鼠接种几种不同佐剂辅佐的hcvdna疫苗后免疫反应的改变。
1 材料与方法
1.1 hcvdna重组质粒的构建 将hcv1a型h株核心、e1、e2蛋白基因(1～746位氨基酸，核酸342～2 579)插入pvax1质粒(美国invitrogen corp.)bamh ⅰ限制酶切点，转化大肠杆菌增殖，用endofree plasmid giga kit(美国qiagen)纯化。将重组质粒转染chok1细胞，裂解细胞做western blot，确定可表达hcv核心和e1、e2蛋白。hcvns3、hcvns5b重组质粒的构建方法同上，插入片段分别为hcvns3基因(1 027～1 657位氨基酸，核酸3 420～5 312)和hcvns5b基因(2 421～3 011位氨基酸，核酸7 602～9 374)。
1.2 hcv重组蛋白抗原的制备
1.2.1 hcvns3重组蛋白［3］ 将hcvns3基因(1 027～1 657位氨基酸，核酸3 420～5 312)插入pqe11质粒(美国qiagen)的限制性内切酶bamh ⅰ位点，转化大肠杆菌dh5αf’iq，western blot选择阳性克隆增殖。溶菌酶溶解细菌，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化蛋白(分子量69 000)，鲎实验检测内毒素含量<0.02 eu/μg。同样方法表达hcvns5b基因(2 421～3 011位氨基酸，核酸位点7 602～9 374)和hcve2基因(384～746位氨基酸，核酸1 491～2 579)，制备hcvns5b重组蛋白(67 000)及截短型(truncated)hcve2重组蛋白。虽然插入hcve2全长基因，且加入蛋白酶抑制剂，但表达的hcve2蛋白仍为29 000而非40 000，因此该蛋白为截短型。
1.2.2 hcv核心蛋白［4］ hcv核心基因(1～164位氨基酸)插入ptrc99a质粒(美国pharmacia)nco ⅰ位点，转化dh5α株大肠杆菌表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化(分子量18 000)。
1.2.3 hcve1/e2重组蛋白 用bactobac baculovirus expression systems(美国invitrogen)。hcv核心、e1和e2基因(1～746位氨基酸，核酸342～2 579)插入供体pfastbac1质粒，转化大肠杆菌dh10bac，供体质粒将目的基因转位至菌体中的bacmid质粒，提取重组bacmid质粒转染sf9细胞株，提取培养液中重组杆状病毒(baculovirus)用于感染sf9细胞。溶解细胞，离心取上清过galanthus nivalis lectin亲和柱层析纯化hcv e1/e2蛋白，过滤除菌。
1.3 佐剂与hcvdna疫苗的混合
1.3.1 ddab/epc脂质体dna的制备［3］ 将3.96 μmol溴化二甲基二八癸胺(dimethyldioctadecylammonium，ddab)与3.96 μmol卵黄卵磷脂(egg yolk phosphatidylcholine, epc)(美国avanti polar lipids)氯仿溶液混合，氮气流吹干，加入0.6 ml注射用水，超声匀浆，再加入dna溶液(1 mg/ml)0.6 ml，充分震荡后于-70℃过夜。次日离心冻干，加入0.1×pbs 60 μl水合1小时，再加入1×pbs 600 μl混匀。
1.3.2 dcchol/dope脂质体dna的制备 将0.72 μmol lα磷脂酰乙醇胺(lαphosphatidylethanolamine, dope)与1.26 μmol和氢氧化胆甾醇基3βn二甲胺乙基氨基甲酸［cholesteryl 3βn(dimethylaminoethyl) carbamate hydrochloride, dcchol］(美国sigma)氯仿溶液混合，氮气流吹干，加入0.6 ml注射用水，超声匀浆，再加入dna溶液(1 mg/ml)0.6 ml，充分震荡后于-70℃过夜。次日离心冻干，加入0.1×pbs 60 μl再水合1小时，再加入1×pbs 600 μl混匀。
1.3.3 氢氧化铝dna混悬液 将0.35 ml的imject alum(含45 mg/ml氢氧化铝和40 mg/ml氢氧化镁)(美国pierce)逐滴加入3 mg/ml的dna溶液0.35 ml中，同时震荡，然后持续震荡30分钟。
1.3.4 montanide isa 720与dna混悬液 将0.35 ml的montanide isa 720(法国seppic)逐滴加入3 mg/ml的dna溶液0.35 ml中，同时震荡，然后持续震荡30分钟。
1.3.5 裸dna溶液 将dna溶于1×pbs中，调整dna浓度为1.5 mg/ml。
1.4 动物免疫 2月龄balb/c雌性小鼠50只(美国harlan)，随机分为10组，每组5只，按所用免疫佐剂分为hcvdna疫苗组和载体质粒dna对照组，见表1。疫苗组每鼠接种的dna由hcv结构区dna、ns3dna和ns5bdna各100 μg混合, 对照组每鼠接种pvax15质粒dna 300 μg。初次免疫后间隔4周再次免疫，再间隔3周行分析前免疫，1周后处死。免疫方法为肌肉注射。
表1 动物分组（略）
tab.1 animal group
1.5 脾淋巴细胞分离及elispot测定 脾淋巴细胞分泌il4、il2和ifnγ的斑点形成单位(spot forming unit, sfu)数量用elispot方法检测。小鼠处死后用70%乙醇浸泡灭菌，用无菌剪刀顺序剪开皮肤、肌肉和腹膜，取出脾脏，放入细胞过滤器(cell strainer，100 mol/l nylon, bd labware, bedford, ma)，将细胞过滤器放入已加入5 ml完全rpmi1640培养基的6孔培养板内，用3 ml注射器的内芯在细胞过滤器上将脾脏研碎至无肉眼可见的组织块，用5 ml完全rpmi1640培养基冲洗研磨棒及细胞过滤器，吹打孔内细胞形成均匀的细胞悬液，然后缓慢加入已加有5 ml ficollpaque plus(amersham pharmacia biotech ab, sweden)的15 ml离心管内，1 500 r/min离心20分钟，吸取淋巴细胞层，用10 ml完全rpmi1640培养基洗涤细胞2次，然后行细胞计数，调整细胞浓度至1×107 ml-1。在24孔培养板上，每孔加入10 μg/ml的rns3抗原溶液0.9 ml，然后加入淋巴细胞悬液0.6 ml，细胞终浓度为4×106 ml-1。将培养板放入co2孵箱，在5%co2、99%湿度、37℃条件下培养40小时。elispot反应板采用以孔径0.45 μm的混合纤维素覆底的maha s45型96孔过滤平板(millipore, bedford, ma)。elispot反应板每孔用50 μl浓度为10 μg/ml纯化的大鼠抗小鼠il4或大鼠抗小鼠il2或大鼠抗小鼠ifnγ抗体(bd pharmingen)包被过夜，次日用5%小牛血清白蛋白100 μl/孔再包被90分钟，用pbs洗板2遍，然后每孔加入经抗原刺激培养后的淋巴细胞悬液100 μl（4×105个细胞），放入co2孵箱内继续培养过夜，使细胞产生il4、il2或ifnγ，并被膜上的相应抗体俘获。第3天弃去细胞悬液，用pbs洗板6遍后，加入50 μl浓度为1 μg/ml的生物素标记的大鼠抗小鼠il4或il2或ifnγ抗体(bd pharmingen)，37℃培养90分钟，以检测被包被抗体所俘获的细胞因子。弃去抗体后，再用pbs洗板6遍，然后加入1∶4 000稀释的sahrp 100 μl，37℃培养90分钟，再经pbs洗板后，加入opti4cn过氧化物酶底物(biorad laboratories, hercules, ca)显色30分钟，自来水洗板终止反应。反应板晾干后，用aid elispot reader system(aid autoimmun diagnostika gmbh, germany)以ifnγ系统为标准，读取每孔的斑点数。所有的实验均有4个复孔，以4个孔的sfu平均值减去相应载体组sfu平均值作为特异性的sfu数值。
1.6 统计学处理 用stata 7.0统计软件进行单因素方差分析，并进行bartlett方差齐性检验，如方差不齐，则采用wilcoxonmannwhitney秩和检验。p<0.05为相差显著。
2 结果
2.1 小鼠脾淋巴细胞对不同抗原的反应 见表2。
2.1.1 对hcvns5b的免疫反应 ddab/epc组ifnγ的分泌显著高于montanide组(p<0.05)，il2的分泌显著高于montanide组、氢氧化铝组和dcchol/dope组(p<0.05或p<0.01)，提示ddab/epc可诱导较强的细胞免疫。氢氧化铝组il4的分泌显著高于其它4组(均p<0.05)，提示氢氧化铝与其它4种疫苗相比，可诱导更强的体液免疫反应。
2.1.2 对hcvns3的免疫反应 ddab/epc组ifnγ的分泌显著高于montanide组和dcchol/dope组(均p<0.05)，il2的分泌显著高于其它4组(均p<0.001)，而il4的分泌显著高于裸dna组(p<0.05)。
2.1.3 对hcve1/e2的免疫反应 ddab/epc组ifnγ的分泌显著高于裸dna组、氢氧化铝组和dcchol/dope组(均p<0.05)，il2和il4的分泌显著高于其它4组(p<0.01或p<0.05)。
2.1.4 对hcve2的免疫反应 ddab/epc组ifnγ和il2的分泌显著高于其它4组(均p<0.01)，il4的分泌显著高于裸dna组和dcchol/dope组(均p<0.01)。
2.1.5 对hcv核心蛋白的免疫反应 ddab/epc组ifnγ和il2的分泌显著高于其它4组(p<0.001)，il4的分泌显著高于裸dna组(p<0.05)；dcchol/dope组ifnγ的分泌显著高于montanide组和氢氧化铝组(均p<0.05)，il2的分泌显著高于montanide组(p<0.05)。
图1 不同抗原刺激后，细胞因子il4/ifnγ的产生（略）
fig.1 il4/ifnγ production profile upon different antigen expansion
表2 经hcv抗原刺激后elispot检测细胞因子的产生（略）
tab.2 cytokines production upon hcv antigen expansion detected by elispot
note:compared with ddab/epc, 1) p<0.05;compared with ddab/epc, 2) p<0.01;compared with imject alum, 3) p<0.05;compared with dcchol/dope, 4) p<0.05. data expressed as the sfu of immunized mice minus the mean sfu value of the corresponding control group. the mean value of the control group(unimmunized) was presented in parenthesis. sfu: spot forming unit.
2.2 不同佐剂对dna疫苗免疫反应特性的影响 见图1。经过5种不同的hcv抗原刺激后，裸dna组和ddab/epc组及dcchol/dope组ifnγ的分泌均高于il4，表明这3种疫苗免疫后小鼠免疫反应是以th1为主；而montanide组和氢氧化铝组，il4的分泌均高于ifnγ，提示这两种疫苗诱导的免疫反应是以th2为主。
3 讨论
将编码抗原的dna分子直接注射到体内，dna分子可被细胞摄取，进入细胞核转染成为核内游离基因，进而表达抗原分子，诱导体液和细胞免疫［5］。裸dna疫苗是将dna直接注射到肌肉，免疫效果依赖于肌细胞摄取dna的能力，有些dna分子可被局部抗原提呈细胞(antigen presenting cells, apc)吞噬，也有些进入淋巴系统，被局部淋巴结内的apc吞噬。研究表明，被apc摄入的dna分子，更有利于诱导免疫反应［6］。
裸dna疫苗免疫效果不理想的主要原因之一是dna分子在进入细胞前被间质核糖核酸酶所降解。脂质体的外层脂质可以保护内部的dna分子免受核糖核酸酶所降解。另外由于dna分子和细胞膜都带负电荷，静电的排斥作用也不利于dna进入细胞。阳离子脂质体由于其正电性，易与细胞膜接近，有利于dna进入细胞，更重要的是阳离子脂质体可能主要被apc摄取，诱导更强的免疫反应［7］。本实验结果表明，小鼠接种阳离子脂质体ddab/epc包被hcvdna疫苗后，脾淋巴细胞在受到hcv核心、e1/e2或e2抗原刺激后，产生的ifn γ显著多于裸dna组及其它3种佐剂组。受ns3刺激后，ifn γ虽较裸dna组有所升高，但无统计学意义。我们前期研究用ddab/epc包被ns3 dna免疫小鼠后，ifn γ的产生显著高于裸dna组［3］。其原因可能是不同序列dna混合后，诱导的免疫反应发生变化。dcchol是一种阳离子性的胆固醇衍生物，它与中性脂质dope形成阳离子脂质体dcchol/dope作为免疫佐剂，可提高单价分割灭活流感疫苗的免疫功效，小鼠皮下接种可诱导以th1为主的免疫反应［8］。用dcchol/dope/epc脂质体作为流感病毒核蛋白dna疫苗佐剂，可显著提高疫苗的体液免疫活性［9］。我们的结果表明，dcchol/dope脂质体对本实验的hcvdna疫苗无明显佐剂效应，仅在受hcv核心抗原刺激后，产生的ifnγ多于montanide isa 720或氢氧化铝组。
montanide为油包水乳剂型免疫佐剂，有montanide isa 720和51两型。montanide isa 720是由植物油和表面活性剂(单油酸二缩甘露醇)构成［10］。这种结构可延缓抗原释放，乳剂可引起局部免疫反应，使apc聚集，表面活性剂可与细胞膜作用，有利于apc摄取抗原，也可能与toll蛋白样受体作用，发挥免疫佐剂功能。montanide isa 720可增强寡核苷酸cpg和多肽疫苗诱导的细胞免疫，效果优于福氏佐剂［11，12］。本实验表明，小鼠接种以montanide isa 720为佐剂的hcvdna疫苗，脾淋巴细胞受hcvns3或ns5b抗原刺激后，细胞因子的产生，尽管统计学上无显著性，但数值上明显低于接种裸dna疫苗鼠，提示montanide isa 720对dna疫苗无免疫辅佐效应，相反由于其制剂的高黏稠性，可能会延缓dna进入细胞表达，对dna疫苗可能会有抑制作用。另外，无论是用hcv结构抗原还是非结构抗原刺激， montanide组小鼠脾淋巴细胞产生的ifnγ均低于il4，说明montanide isa 720还会将dna疫苗th1免疫反应为主的特性转换为以th2免疫反应为主。
铝制剂作为免疫佐剂用于临床已有50多年的历史。水溶性抗原可在铝凝胶中缓慢释放，延长抗原与免疫系统的作用时间，还可与补体、酸性粒细胞和巨噬细胞相互作用，激活apc，增加apc摄取抗原的效率，为增强th2免疫反应的佐剂［13］。我们的结果表明，小鼠接种铝佐剂hcvdna疫苗，受hcvns5b刺激时，淋巴细胞产生的il4显著高于其它佐剂或裸dna组，提示在此种情况下，氢氧化铝可诱导较其它佐剂更强的th2反应。另外，接受铝佐剂hcvdna疫苗的小鼠淋巴细胞受抗原刺激后，il4的产生明显高于ifnγ，说明铝佐剂可使dna疫苗的免疫反应从th1为主转为th2为主。这与peng等［14］报道相似。
因此，根据我们的实验结果，ddab/epc对hcvdna疫苗的辅佐作用最好，可增强dna疫苗诱导的th1免疫反应，而dcchol/dope辅佐作用不明显；氢氧化铝似可增强dna疫苗诱导的th2免疫反应，而montanide isa 720似可减弱dna疫苗免疫反应；氢氧化铝和montanide isa 720可改变dna疫苗的免疫反应特性，使其由th1为主转为th2为主。
【参考文献】
1 who and the viral hepatitis prevention board. global surveillance and control of hepatitis c ［j］. j viral hepat, 1999;6(1):3547.
2 berzofsky j a, ahlers j d, janik j et al. progress on new vaccine strategies against chronic viral infections ［j］. j clin invest, 2004;114(4):450462.
3 jiao x, wang r y, feng z et al. modulation of cellular immune response against hepatitis c virus nonstructural protein 3 by cationic liposome encapsulated dna immunization ［j］. hepatology, 2003;37(2):452460.
4 chen z p, berkower i, ching w m et al. identification of a murine cd4+tlymphocyte response site in hepatitis c virus core protein ［j］. mol immunol, 1996;33(78):703709.
5 gregoriadis g, bacon a, caparroswanderley w et al. a role for liposomes in genetic vaccination ［j］. vaccine, 2002;20(suppl 5):b1b9.
6 gregoriadis g, saffie r, de souza j b. liposomemediated dna vaccination ［j］. febs lett, 1997;402(23):107110.
7 velinova m, read n, kirby c et al. morphological observations on the fate of liposomes in the regional lymphs nodes after footpad injection into rats ［j］. biochim biophys acta, 1996;1299(2):207215.
8 guy b, pascal n, francon a et al. design, characterization and preclinical efficacy of a cationic lipid adjuvant for influenza split vaccine ［j］. vaccine, 2001;19(1314):17941805.
9 perrie y, mcneil s, vangala a. liposomemediated dna immunization via the subcutaneous route ［j］. j drug target, 2003;11(8):555563.
10 aucouturier j, dupuis l, deville s et al. montanide isa 720 and 51: a new generation of water in oil emulsions as adjuvants for human vaccines ［j］. expert rev vaccines, 2002;1(1):111118.
11 jones t r, obaldia n, gramzinski r a et al. synthetic oligodeoxynucleotides containing cpg motifs enhance immunogenicity of a peptide malaria vaccine in aotus monkeys ［j］. vaccine, 1999;17(2324):30653071.
12 osorio y, cohen j, ghiasi h. improved protection from primary ocular hsv1 infection and establishment of latency using multigenic dna vaccines ［j］. invest ophthalmol vis sci, 2004;45(2):506514.
13 petrovsky n, aguilar j c. vaccine adjuvants: current state and future trends ［j］. immunol cell biol, 2004;82(5):488496.
14 peng h j, tsai l c, su s n et al. comparison of different adjuvants of protein and dna vaccination for the prophylaxis of ige antibody formation ［j］. vaccine, 2004;22(56):755761.
