【摘要】 目的：探讨hcgβ粘膜避孕疫苗体液免疫的分子机制。方法：分别用1010个重组乳酸杆菌lb.pilac、lb. pilachcgβ经小鼠生殖道粘膜途径免疫6～8周龄balb/c小鼠，3周后相同剂量加强免疫1次。间接elisa检测加强免疫后2周阴道灌洗液中抗hcgβ igg和iga抗体滴度；elispot检测分泌抗hcgβ igg和iga抗体分泌细胞数；rtpcr筛查小鼠子宫b细胞上18种趋化因子受体和相关趋化因子ccl25；fcm和elisa分析ccr9/ccl25的表达。结果：经小鼠生殖道粘膜接种1010 lb. pilachcgβ可在生殖道局部诱导产生抗hcgβ igg和iga抗体, 且以igg抗体为主；局部存在抗hcgβ igg和iga抗体分泌细胞，而以igg 抗体分泌细胞为主；粘膜免疫后，小鼠生殖道局部b细胞上ccr9表达增高，粘膜局部相应配体ccl25表达亦增高。结论：重组乳酸杆菌活疫苗lb. pilachcgβ经小鼠生殖道粘膜免疫可诱导有效的免疫应答；粘膜局部ccr9/ccl25可介导b细胞归巢至生殖道局部，这可能增强hcgβ粘膜避孕疫苗的避孕效果。
【关键词】 hcgβ 粘膜免疫 ccr9/ccl25 b细胞 归巢
ccr9/ccl25 engaged in b cell homing at murine genital tract after immunization via vagina with lactobacillus expressing hcgβ
he xiaoju, tang chuanling, li mingqing，yao xiaoying,li dajin.
laboratory for reproductive immunology，hospital & institute of obstetrics & gynecology，fudan university shanghai medical college，shanghai 200011，china
［abstract］ objective:to investigate the mechanism for b cell homing in murine genital tract after inoculation of lactobacillus expressing hcgβ via vagina.methods:balb/c mice were inoculated intravaginally with 1010 lb. pilac and lb. pilachcgβ, respectively, followed by a boost in three week interval. the titers of antihcgβ igg/iga antibody in vaginal douche two weeks after the secondary immunization were determined by indirect enzymelinked immunosorbent assay(elisa). the igg/iga antibody producing cells(ascs) levels in all the immunized groups were evaluated with elispot assay.transcription of chemokine receptors in murine uterine b cells of both groups were analyzed by rtpcr, and ccr9 expression was analyzed by fcm. the levels of ccl25 in uterus were investigated by rtpcr and elisa.results:the antihcgβ igg and iga antibody titers could be detected in vaginal lavage of lb. pilachcgβ immunization could be detected, and antihcgβ igg antibody was the major one. the levels of igg and iga ascs of lb.pilachcgβ immunization were detected in the uterus, with the level of igg ascs higher than that of iga ascs. the expression of ccr9 on b cells in murine genital tract significantly increased after immunization with lb. pilachcgβ compared to the control, and the expression of ccl25 as well.conclusion:mucosal immunization with lactobacillus expressing hcgβ via murine vagina can induce effective immune responses, and the specific antihcgβ antibody may be secreted by ascs in genital tract. ccr9/ccl25 is involved in the homing of b cells into murine genital tract, which might lead to optimal contraceptive efficiency of hcgβ mucosal vaccination.
［key words］ hcgβ；mucosal immunization；ccr9/ccl25；b cell；homing
粘膜是机体与外界接触的重要屏障，也是外源抗原进入机体的主要门户。wWW.133229.cOM粘膜免疫系统包括那些与身体内表面相关的粘膜相关淋巴组织（malt）,分布在胃肠道、上下呼吸道和泌尿生殖道,它面积巨大,仅分布于人的胃肠道的面积就有400平方米, 200倍于皮肤表面。健康成人malt中的免疫细胞占全身免疫细胞总数的80%，由此可见粘膜是人体的最大免疫器官。粘膜免疫系统担负着哨兵的责任，区分无害与有害, 从而决定是放过去(免疫耐受)还是拦下来(免疫反应)［1］。这点在女性生殖道粘膜意义重大，其免疫应答既涉及对细菌病毒等病原体的抵御，又涉及同种异体的精子、胎儿的耐受，因此有其特殊性［2］。而长期以来因为女性生殖道缺乏典型的m细胞和集合淋巴组织等被认为是弱免疫效应部位而被研究者忽略，本文通过经小鼠生殖道粘膜免疫，来观察发生在生殖道局部的免疫应答，并试图解析其可能的机制。我们以前的研究已证明，用表达hcgβ的重组乳酸杆菌经生殖道免疫小鼠可产生抗hcgβ igg和iga的粘膜免疫应答，同时检测到生殖道局部有特异性抗体分泌细胞（ascs）［3，4］。本文的目的是探讨b细胞（asc）归巢到生殖道的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 疫苗
lb.pilachcgβ由本实验室前期构建［3］。
1.1.2 实验动物
雌性balb/c小鼠购自中国科学院上海分院实验动物中心。
1.1.3 主要试剂和仪器
引物设计和合成（invitrogen公司）；偶联辣根过氧化物酶（hrp）的羊抗小鼠igg（h+l）（kpl公司）；hrp羊抗小鼠iga（southern biotechnology公司）；b细胞磁珠分选试剂盒和ls分离柱、磁珠分离器：（miltenyi biotec公司）；96孔硝酸纤维素膜微量板（millipore公司产品）；胎牛血清、percoll分离液、生物素化抗小鼠igg、亲和素过氧化物酶复合物（abc）（华美生物工程有限公司）；rtpcr试剂（invitrogen公司）；fitcantimouse ccr9（bd pharmingen公司）；mouse ccl25/teck elisa 试剂盒（r&d公司）；facs calibur流式细胞仪（becton dickinoson公司）。
1.2 动物免疫
balb/c小鼠（鼠龄6～8周，体重20～22 g）随机分2组，分别用疫苗lb.pilac （空质粒作对照组）、lb.pilachcgβ经阴道免疫。每组免疫剂量为1010，每一组样本量均为10。 3周后加强免疫1次。
1.3 抗hcgβ igg/iga抗体效价分析
加强免疫后2周取小鼠阴道灌洗液。间接酶联免疫吸附法（elisa）测定抗hcgβ igg/iga抗体效价。用hcgβ 抗原包被96孔酶标板，包被浓度为0.5 μg/ml。封闭后复孔加入1∶10～1∶105系列稀释的待测小鼠血清，二抗为偶联hrp的羊抗小鼠igg（h+l）/iga，h2o2tmb系统显色，酶标仪读取od450值。样品od值/pbs阴性对照od值>2.1为阳性；抗血清最高稀释度呈阳性者，其稀释度的倒数即为抗血清效价。
1.4 固相酶联免疫斑点技术（elispot法）检测特异性hcgβ igg/iga抗体分泌细胞
加强免疫后2周，percoll不连续密度梯度沉淀法分别制备lb.pilachcgβ、lb.pilac免疫组小鼠子宫淋巴细胞细胞悬液，elispot法分析两免疫组小鼠子宫hcgβ抗原特异性igg/iga抗体分泌细胞。方法如下：将15 μl的70%乙醇加入到pvdf膜板的每一个孔中，30秒后去除乙醇，并用200 μl的pbs清洗pvdf膜板2遍；将适量浓度（20 μg/ml）的hcgβ抗原100 μl/孔包被于96孔pvdf膜板，封板后放置于4℃过夜；弃去包被液，pbst洗板1次；pvdf膜板每孔中加入封闭液（含5%fcs的pbs）200 μl，37℃封闭1小时；每孔加入hcgβ抗原（0.5 μg/ml）和子宫淋巴细胞悬液（浓度为2×105个细胞/ml）各100 μl于pvdf膜板中；封板，37℃、5%co2孵育48小时；去离子水洗板2次，每次放置3～5分钟；用200 μl pbst洗板3次后，加入生物素化抗小鼠igg 100 μl/孔，37℃孵育1小时；用pbst洗板3次，每次放置1～2分钟；每孔加入亲和素过氧化物酶复合物（abc）100 μl，37℃孵育1小时；用pbst洗板4次，每次放置1～2分钟；用pbs洗板2次，每次放置1～2分钟；每孔加入dab显色液50 μl，室温暗处放置；酶联免疫斑点图像自动分析仪观察斑点显色（一般15～30分钟，也可能延长和缩短），用去离子水洗板终止反应。一个斑点代表一个抗体分泌细胞。
1.5 rtpcr筛查子宫b细胞趋化因子受体和子宫组织中ccl25的转录
加强免疫后第2周末，制备子宫淋巴细胞悬液，免疫磁珠阳性分选法分别纯化各免疫组小鼠子宫b细胞。免疫磁珠阳性分选法如下：pbs洗涤子宫淋巴细胞2次，2 500 r/min离心10分钟；弃上清，用pbs/edta/fcs缓冲液重悬细胞，计数细胞总数；2 500 r/min离心10分钟，完全弃上清，每107细胞加入pbs/edta/fcs缓冲液90 μl重悬；每107细胞加入cd19磁珠10 μl，充分混匀，在4℃～8℃孵育15分钟；每107细胞加入1～2 ml的缓冲液，2 500 r/min离心10分钟；弃上清，用500 μl缓冲液重悬；取一个ls分离柱，置于磁珠分离器上，用3 ml缓冲液冲淋分离柱后，将细胞悬液过柱，并用3 ml缓冲液×3次冲洗分离柱，最后，加5 ml缓冲液用柱栓立即加压冲出磁珠标记的细胞，2 500 r/min离心10分钟，即得到纯化的b细胞。经流式细胞术检测b细胞的纯度>85%。
首先trizol提取细胞的总rna，invitrogen公司提供的superscript ⅲ firststrand synthesis system for rtpcr试剂盒，按试剂盒说明逆转录cdna，然后pcr，琼脂糖凝胶电泳。引物序列见表1。表1 趋化因子受体/趋化因子及看家基因gapdh引物序列（略）
1.6 fcm分析子宫b细胞ccr9的表达
制备子宫淋巴细胞悬液，1 μg/105 cells鼠igg阻断，室温下15分钟，取105细胞加fitcantimouse ccr9抗体或其同型对照，4℃孵育30分钟，pbs洗涤2次，pbs重悬细胞，上流式细胞仪，cell quest plot软件分析。
1.7 elisa检测子宫组织ccl25的表达
剪碎子宫，1 ml pbs制备子宫组织上清，按elisa试剂盒说明操作，检测子宫组织上清ccl25的分泌水平。
1.8 统计学方法
应用统计软件spss 11.5进行结果分析，实验数据以x±s表示。采用t test进行两组间均数比较，oneway anova进行组间样本均数比较，以p<0.05作为差异显著性标准。
2 结果
2.1 阴道灌洗液抗hcgβ igg/iga抗体水平
elisa结果显示，经lb. pilachcgβ疫苗粘膜免疫后能够在生殖道局部产生抗hcgβ igg和iga抗体，且抗体以igg型为主，有显著性差异（p<0.01），见图1。
2.2 子宫igg/iga ascs 水平 elispot分析显示，在lb.pilachcgβ免疫组子宫组织中，以 igg ascs为主，有明显差异（p<0.05），见图2。
2.3 子宫b细胞各趋化因子受体转录水平
结果显示lb.pilac、lb.pilachcgβ组子宫b细胞各种趋化因子受体转录水平，其中ccr3、ccr7、ccr8、ccr9、ccr10、cxcr4、cxcr5在各组均有表达，而只有ccr3和ccr9在两组之间表达有明显差异（p<0.05），因为ccr9与淋巴细胞归巢有密切的关系，我们重点关注这个趋化因子受体。
2.4 子宫b细胞ccr9的蛋白水平
fcm研究结果显示，经lb.pilachcgβ免疫后，子宫b细胞ccr9的表达升高，且lb.pilachcgβ免疫组显著高于lb.pilac免疫组（p<0.01），见图4。
2.5 子宫组织ccl25的转录水平
lb.pilachcgβ免疫组子宫组织中ccl25表达均明显高于对照组（p<0.01），见图5。
2.6 elisa检测子宫组织ccl25分泌水平
lb.pilachcgβ免疫组子宫组织中ccl25的分泌均高于对照组（p<0.05），见图6。
3 讨论
hcgβ避孕疫苗经粘膜免疫的目的，是增加生殖道局部的特异性抗体水平，更好地起到避孕效果。我们以往的研究已证明，用表达hcgβ的重组乳酸杆菌经生殖道免疫小鼠可产生抗hcgβ igg和iga的粘膜免疫应答［3］。同时检测到生殖道局部有特异性抗体分泌细胞（ascs），推测局部的特异性抗体主要是由归巢到生殖道的ascs分泌的［4］。
一直以来，因为女性生殖道缺乏典型的m细胞和集合淋巴组织等被认为是弱免疫效应部位而被研究者忽略。然而，早在上世纪70年代就发现在口服脊髓灰质炎疫苗后可在子宫、宫颈和阴道分泌物中产生特异性抗体［5］。在动物实验中，局部给予不同的抗原，在生殖道局部都可产生特异的iga和igg抗体，证明在女性生殖道可诱导局部免疫应答［6］。人类女性生殖道粘膜系统表达的免疫球蛋白成分也有其特点，尽管有siga，但igg更丰富，不同于其他粘膜免疫应答的典型malt［7］。本研究结果显示小鼠生殖道局部产生的抗体以igg型为主，asc亦以igg为主，与上述理论相一致。
淋巴细胞成功地归巢到一个靶器官，有赖于相关的趋化因子及粘附分子的参与，趋化因子及粘附分子的存在是淋巴细胞归巢的分子机制。有研究认为，趋化因子受体ccr10的配体ccl28在各种粘膜上皮组织的表达，可能是小肠iga ascs能够到达各种粘膜部位的原因，也是共同粘膜免疫系统的标志［8］。不同粘膜部位的淋巴细胞表达的粘附分子、趋化因子受体和粘膜上皮表达的粘附分子、趋化因子配体不同：呼吸道粘膜诱导的iga ascs，因为缺乏表达ccr9，所以被限制不能游走到小肠粘膜；归巢到皮肤的t细胞表达ccr10，但不表达α4β7，就不能归巢到粘膜部位。本实验中子宫局部b细胞上ccr7、ccr9、ccr10、cxcr4、cxcr5在各组均有表达，这些趋化因子受体都可能与b细胞归巢有关，但其中只有 ccr9在免疫后表达明显增高，提示它与b细胞归巢到生殖道粘膜的关系可能比其他趋化因子更为密切。
ccr9/teck在小肠粘膜中研究最多。在人体，小肠中90%以上的t细胞都表达ccr9，无怪乎有人把ccr9当作生理条件下小肠中t细胞的代名词［9，10］。在小肠，除了t细胞的归巢，b细胞的归巢也与ccr9/teck有关。无论在小鼠还是在人，小肠粘膜淋巴组织中的iga ascs上均有ccr9表达。有学者认为，iga ascs可能利用ccr9/teck归巢到小肠。ccr9/teck对效应b细胞同样重要［11］。在本研究中，小鼠子宫组织中b细胞上ccr9在免疫后明显增高，提示ccr9/teck可能参与了生殖道b细胞的归巢，这似乎与小肠的归巢模式相似，提示ccr9/teck并非小肠粘膜归巢所独有，ccr9/teck亦可能在生殖道发挥作用。然而，即使在小肠ccr9也不是仅有的趋化因子，尚有其他如ccr7、ccr6、cxcr3、ccr5、cxcr4均参与t细胞的归巢。ccr9/teck可能与其他趋化因子及其受体一道参与生殖道b细胞的归巢。
正是由于有非特异性的粘附分子如cd44和特异性的粘附分子、趋化因子的表达，从而能定向的趋化诱导淋巴细胞到靶粘膜局部发挥作用，产生有效的免疫效应，构成了共同粘膜免疫应答和粘膜免疫局部反应特性的分子基础［8］。
除了趋化因子和粘附分子，其他的可溶性分子如各种细胞因子和生长因子以及神经内分泌系统均能影响b细胞的归巢。b细胞归巢是一个复杂过程，b细胞与微环境之间的双向对话导致归巢过程的连续性调整。竞争性归巢到靶器官, 在控制淋巴细胞自稳方面发挥着重要作用。有关淋巴细胞归巢的研究成果对免疫性疾病的防治、粘膜疫苗的研制均具有重大意义。
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