【摘要】 目的 检测il-10和il-12在结直肠癌组织中含量及术前和术后3周血清浓度并探讨其意义。方法 采用elisa法检测了46例结直肠癌il-10和il-12在癌组织和癌周组织中含量及术前和术后3周血清浓度，与24例良性结肠息肉患者资料为对照。结果 结直肠癌组织il-10含量高于癌周组织，而癌组织il-12含量低于癌周组织；ⅲ、ⅳ期患者癌组织和癌周组织中il-10含量高于ⅰ、ⅱ期， 而ⅰ、ⅱ期癌组织和癌周组织中il-12含量高于ⅲ、ⅳ。术前和术后1周血清il-10升高而il-12降低，术后3周血清il-10和il-12浓度接近对照组。癌组il-10和il-12呈明显负相关。结论 结直肠癌细胞可分泌il-10抑制il-12的产生，进而营造免疫抑制微环境，动态检测il-10和il-12可反映结直肠癌病期、判断疗效和估计预后。
【关键词】 结直肠癌；il-10；il-12
the examination and clinical significance of il-10 and il-12 in colorectal carcinoma
liu xingchun, yao lianbo, liao maohu. department of general surgery, the steel hospital, guangzhou 510380, china；zhang lei. department of general surgery, the second affiliated hospital, zhongshan university, guangzhou 510120, china.
［abstract］ objective to investigate the clinical significance of interleukin-10 (il-10) and interleukin-12 (il-12) in colorectal carcinoma. methods the content of il-10 and il-12 were examined in colorectal carcinoma and its adjacent tissues by elisa assay, and so did the concentration in the serum before operation， 1 and 3 weeks after operation in 46 cases of colorectal carcinoma and 24 cases of benign colonic polyp chosen as control. results the content of il-10 in carcinoma tissues was higher significantly than that in adjacent tissues, and contra versus about il-12. the contents of il-10 were higher in ⅲ and ⅳ stages than that of ⅰ and ⅱstages, and contra versus about il-12. the concentrations of serum il-10 decreased before and one week after operation, and contra versus about il-12. but 3 weeks after operation, the level of il-10 and il-12 reached proximally to the level of the control group. there was negative correlation between il-10 and il-12 in tumor tissues and serum. conclusion in patients with colorectal carcinoma, carcinoma cell may secrete il-10 to suppress il-12, which therefore creates microenvironment of immune suppression. of il-10 and il-12 can reflect colorectal carcinoma stage, judge curative effect and estimate prognosis.
［key words］ colorectal carcinoma;interleukin-10;interleukin-12
肿瘤细胞能分泌抑制性细胞因子，抑制患者免疫效应细胞的粘附能力与杀伤能力，或者释放可溶性抗原分子封阻抗体介导的细胞毒效应（antibody dependent cell mediated cytotoxicity, adcc） ［1］；而且肿瘤细胞分泌的抑制性细胞因子，可以以旁分泌的形式，弥散在肿瘤组织周围，制造一个免疫抑制微环境［2,3］。wwW.lw881.com白细胞介素-10（interleukin-10,il-10）是代表性的抑制性细胞因子而白细胞介素-12（interleukin-12,il-12）可介导免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞［4～6］，结直肠癌患者血清il-10和il-12浓度变化报道较少，且癌组织和癌周组织中il-10和il-12含量的检测尚无报道。本实验检测了结直肠癌患者癌组织和癌周组织中il-10、il-12的含量及围手术期血清il-10、il-12浓度变化并探讨其意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本组结直肠癌46例，男33例，女13例，年龄29～81岁，平均(56.4±5.6)岁。所有患者术前电子结肠镜检查，镜下活检病理提示为结直肠癌。术后病理检查证实其中低分化腺癌12例，中低分化腺癌13例，中分化腺癌7例，印戒细胞癌8例，高分化腺癌7例；dukes分期：a期6例，b期15例，c期20例，d期5例。
1.2 标本收集 每例术前于清晨6 h空腹抽静脉血5 ml，再于术后第7 d和第21 d清晨6 h空腹各抽静脉血5 ml，抗凝处理后，常温下静置1 h，3000 rpm离心5 min，吸取上清，-20℃保存，标本满24个时检测。46例于根治术中切取肿瘤组织后5 min内，解剖标本，切取肿瘤组织约1.0 cm×1.0 cm大小，立即放入pbs缓冲液中密封，4℃保存待检。取24例结直肠良性息肉组织和治疗前空腹血作为对照。
1.3 组织匀浆的制备 于pbs缓冲液中取出组织块，吸水纸吸干后准确称重，按1∶10比加入无菌pbs缓冲液，用眼科剪剪碎组织，移入200mu无菌不锈钢筛，注射器柄研磨5 min制成组织匀浆，于50 ml离心管内4℃状态3000 rpm离心5 min，取上清液，-20℃冻存，标本满24个时检测。
1.4 血清及组织匀浆上清液il-10和il-12的测定 人il-10和il-12的elisa试剂盒均购自美国eb公司，具体测定方法步骤按说明书进行：用俘获抗体包被96孔板，4℃孵化过夜。吸干孔内液体，每孔加300 μl洗涤液，共洗涤3次。每孔加200 μl的assay diluent封闭，室温下孵化1 h。吸干封闭液后洗涤板孔。除空白孔外，分别将不同浓度（2倍连续稀释）标准品、待测血清加入相应的反应孔中（100 μl/孔），每个标本设3个复孔。用封板胶纸封住反应孔，置37℃孵箱孵育2 h。重复吸干、洗涤板孔5次。除空白孔外，每孔加入抗体工作液100 μl，用封板胶纸封住反应孔，置室温孵育1 h。重复吸干、洗涤板孔5次。除空白孔外，每孔加入酶结合物工作液100 μl，用封板胶纸封住反应孔，置室温下孵箱孵育30 min。重复吸干、洗涤板孔7次。每孔加底物溶液100 μl，室温下孵箱孵育15 min。每孔加终止液50 μl［7］。反应完毕后，即刻在酶标仪上读取样本孔及标准品孔的od450nm值和od570nm值，以二者差值和对应的细胞因子浓度的常用对数值，分别作纵、横坐标，绘制标准曲线，从标准曲线求出样本的细胞因子浓度。
1.5 统计学处理 所有计量资料的描述采用均数±标准差（x±s），研究组和对照组间均数比较应用独立t检验进行比较，研究组前后比较采用t检验，非正态分布计数资料组间比较用mann-whitney u检验，il-10、il-12两者间的相关性采用spearman相关分析，α设定为0.05。所有数据均在计算机spss13.0统计软件上进行运算。
2 结 果
2.1 结直肠癌患者癌组织和癌周组织的il-10含量均高于良性息肉组织（p<0.05），而il-12含量低于良性息肉组织（p<0.05）；癌组织中il-10含量高于癌周组织，而il-12含量低于癌周组织（p<0.05）。见表1。表1 结直肠癌组织、癌周组织以及良性息肉组织中il-10、il-12含量（略）
2.2 ⅲ、ⅳ期结直肠癌患者癌组织和癌周组织中il-10含量均高于ⅰ、ⅱ期癌组织和癌周组织（p<0.05），而ⅲ、ⅳ期癌组织和癌周组织中il-12含量均低于ⅰ、ⅱ期癌组织和癌周组织（p<0.05）。见表2。表2 不同分期结直肠癌组织以及癌周组织中il-10、il-12含量（略）
2.3 直肠癌患者术前和术后1周的血清il-10含量高于对照组（p<0.05），而il-12含量低于对照组和术后3周（p<0.05）；术后3周血清il-10和il-12含量和对照组无明显差异（p>0.05）。见表3。表3 手术前后结直肠癌组织以及癌周组织中il-10、il-12含量（略）
2.4 ⅲ、ⅳ期结直肠癌患者术前血清中il-10含量均高于ⅰ、ⅱ期（p<0.05），而ⅲ、ⅳ期结直肠癌患者术前血清中il-12含量均低于ⅰ、ⅱ期（p<0.05），术后3周ⅲ、ⅳ期结直肠癌患者术前血清中il-10、il-12含量和ⅰ、ⅱ期无明显统计学意义（p>0.05）。见表4。表4 术前和术后3周不同分期结直肠癌血清il-10、il-12浓度比较（略）
2.5 il-10、il-12两者间相关性：经sperman检验，il-10和il-12之间呈负相关性，相关系数r=-0.622(p<0.05)。
3 讨 论
il-10作为重要的免疫负向调节因子，除了主要由th2细胞分泌外，很多恶性肿瘤细胞都有过量表达，如肾癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、皮肤基底细胞癌、黑色素瘤及神经母细胞瘤等，均证实可转录il-10的mrna［1］。il-10主要抑制t细胞和nk细胞的增殖杀伤功能，亦可抑制单核细胞mhcii类抗原的表达和干扰ifn-r对巨噬细胞的活化［2,4］。
il-10的局部过量分泌会产生瘤周免疫抑制的微环境，不利于恶性肿瘤的免疫治疗；而全身性的il-10升高抑制了机体抗肿瘤的免疫杀伤效应，导致机体免疫低下［5,8］。本研究发现，结直肠癌患者血清il-10浓度以及癌组织和癌周组织内il-10含量均高于良性息肉患者，这说明在结直肠癌患者中，普遍存在着免疫低下和免疫抑制。而且，血清il-10浓度ⅲ、ⅳ期高于ⅰ、ⅱ期，说明随着临床分期的增加，结直肠癌发生演进现象，恶性度趋于增加，免疫抑制加强；提示结直肠癌细胞可能分泌il-10逃避机体之免疫监视作用。另外行根治术后其浓度逐步下降，于术后3周，血清il-10的浓度接近良性结肠病患者，说明手术后，宿主的肿瘤负荷减少或消失，免疫抑制得到了解除。本研究结果提示il-10可作为结直肠癌根治术后估计预后和预测复发的一个指标，检测血清il-10浓度变化对临床治疗有指导意义。
il-12又名自然杀伤细胞（nk细胞）刺激因子，主要由辅助性th1细胞产生，以旁分泌或自分泌方式发挥其生物学效应。il-12能促进nk细胞及t细胞的增殖、增强免疫效应细胞的溶细胞活性以及诱导t细胞产生ifn-r［9,10］。本研究发现，荷瘤宿主血清il-12水平明显降低，瘤周以及瘤内il-12含量下降，而且肿瘤越是趋于中晚期，il-12下降越明显，这说明宿主载瘤状态下，机体免疫监护和免疫杀伤效应低下；而且我们研究发现，il-12水平和il-10呈负相关，这说明恶性肿瘤有可能通过il-10途径抑制了机体的免疫水平。
这些研究均提示在荷瘤状态下，结直肠癌患者存在着免疫抑制，随着肿瘤的演进，机体免疫抑制越严重；行肿瘤根治切除或姑息性大部分切除后，机体的肿瘤负载下降或消失，可缓解肿瘤对患者免疫功能的抑制。因此，检测结直肠癌患者癌组织和癌周组织中il-10、il-12的含量及围手术期血清il-10、il-12水平的动态变化，对反映结直肠癌病期、判断疗效及估计预后等有一定的意义。
【参考文献】
［1］ willimsky g, blankenstein t.sporadic immunogenic tumours avoid destruction by inducing t-cell tolerance. nature［j］, 2005, 437(7055):141-146.
［2］ yang l, carbone. tumor-host immune interactions and dendritic cell dysfunction［j］. adv cancer res, 2004, 92(1): 13-27.
［3］ yu p, lee y, liu w, et al. intratumor depletion of cd4+ cells unmasks tumor immunogenicity leading to the rejection of late-stage tumors［j］. j exp med, 2005, 201(5): 779-791.
［4］ yang as, lattime ec. tumor-induced interleukin-10 suppresses the ability of splenic dendritic cells to stimulate cd4 and cd8 t-cell responses［j］. cancer res, 2003, 63(9): 2150-2157.
［5］ pawelec g. tumour escape: antitumour effectors too much of a good thing?［j］ cancer immunol immunother. 2004, 53(3): 262-274.
［6］ wu s, wang so, zhang j, et al. native anti-tumor responses elicited by immunization with a low dose of unmodified live tumor cells［j］. int j oncol, 2006, 28(3): 731-736.
［7］ 王凌云, 黄开红, 闵军, 等. 胃癌患者外周血调节性t细胞的多种细胞因子水平的检测及其意义［j］. 中华实验外科杂志, 2006, 23(11): 1375-1377.
［8］ nikolova pn, pawelec gp, mihailova sm, et al. association of cytokine gene polymorphisms with malignant melanoma in caucasian population［j］. cancer immunol immunother. 2007, 56(3): 371-379.
［9］ riemensberger j, bohle a, brandau s. ifn-gamma and il-12 but not il-10 are required for local tumour surveillance in a syngeneic model of orthotopic bladder cancer［j］. clin exp immunol. 2002, 127(1): 20-26.
［10］ kawamata a, ito d, odani t, et al. thalidomide suppresses melanoma growth by activating natural killer cells in mice［j］. oncol rep. 2006, 16(6): 1231-1236.
