乳腺癌及癌旁组织中VEGF及survivin2B mRNA的表达意

【摘要】 目的： 观察乳腺癌及癌旁组织中vegf及survivin2b mrna表达情况，并探讨其与临床病理学指标的关系. 方法： 以逆转录聚合酶链反应（rtpcr）法检测60例乳腺癌及癌旁5 cm正常乳腺组织标本vegf及凋亡抑制因子survivin剪接体survivin2b mrna表达，半定量分析电泳结果. 结果： 在60例乳腺癌标本中vegf及survivin剪接体survivin 2b mrna均高表达，与癌旁正常乳腺组织中差异有统计学意义（p<0.01）, vegf mrna及survivin2b在乳腺癌组织中的高表达呈正相关（r=0.576, p<0.05），同时vegf及survivin2b mrna的表达与淋巴结转移有关（r=0.482，p<0.05）. 结论： vegf及survivin2b因子为乳腺癌发生、发展过程中的重要因子，可对患者的治疗及预后作预测.

【关键词】 乳腺肿瘤 基因 血管内皮生长因子类 survivin

0引言

随着人民生活水平的提高，生活环境的变化及各种影像学检查的完备，乳腺癌检出率逐步提高,近年来其发病率呈明显上升趋势，已列为女性恶性肿瘤的首位. 如何尽早发现乳腺病变成为目前重要的研究课题. 肿瘤的发生和发展是一个多基因和环境因素参与的过程，研究证实肿瘤的生长有赖于血管向其提供充足的营养，为其细胞增殖、侵袭和转移提供必要的物资条件. survivin2b是近年来发现的survivin［抗凋亡因子，凋亡抑制家族（iap）中的新成员］的剪接体，是survivin中最具特异性因子［1］. 我们采用rtpcr检测乳腺癌及癌旁正常乳腺组织中vegf及survivin2b的扩增情况，与临床病理学指标对比分析，以探讨vegf及survivin2b与乳腺癌浸润和转移的关系.

1材料和方法

1.1材料我院200205/200803乳腺癌患者切除的癌组织及距肿瘤5 cm的癌旁非癌乳腺组织标本，能进行随访并经病理证实为乳腺癌的石蜡包埋组标本60例，均为女性，术前均未行化疗、放疗和内分泌治疗. 患者年龄25～68（平均48）岁. ⅰ期11例，ⅱ期39例，ⅲ期10例. 原位癌38例，有腋窝淋巴结转移的22例. 行乳腺癌根治术12例，改良根治术48例. trizol试剂盒（美国invitrogen公司），mmlv逆转录酶，rnasin和gotaq green master mix均购自美国promega公司. 引物由上海生工公司合成. 梯度pcr仪及凝胶成像系统quantity one version 4.6.3（美国biorad公司）.

1.2方法vegf上游引物5′ggagcttcaggacattgctgtg3′，下游引物为5′ggaggaaggtcaaccactcac3′, 扩增片段353 bp, 由于survivin共有5条条带，故设计引物控制能出现的条带为survivin及其剪接体survivin△ex3,survivin2b 3条条带，共有上游引物为5′gagaacgagccagacttggc3，下游引物为 5′cctctggtgccactttcaaga3′，扩增片段461 bp，344 bp，530 bp. gapdh上游引物为5′agtccactggcgtcttcac3′，下游引物为5′gcttgacaaagtggtcgttgag3′;扩增片段639 bp. 用trizol试剂提取乳腺癌、癌旁组织总rna. rna纯度a260/a280均在1.8～2.0之间. rt反应体系：模板rna 2 μg， oligodt18 0.5 μg，70℃变性5 min,冰上冷却5 min，加入5×rt缓冲液5 μl, dntps 1.25 μl(each 10 mmol/l), rnasin 416.75 nkat, mmlv 3334 nkat，1 ml/l depc水补至反应终体积25 μl，42℃反应60 min，72℃反应15 min，合成的cdna置-20℃保存. pcr反应体系：在反应体系25 μl中gotaq green master mix 12.5 μl，上下游引物各0.8 μmol/l，cdna 1.5 μl，nucleasefree water 7.0 μl，入pcr仪. 反应条件：95℃预变性2 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环，72℃延伸 5 min. 取10 μl pcr产物在含有溴化已锭的10 g/l琼脂糖凝胶上电泳，5 v/cm，在凝胶成像系统下成像分析. 将gapdh条带的吸光度值定为10，取目的基因条带与gapdh条带吸光度值的比值作为目的基因的相对值.

统计学处理：采用秩和检验方法，用spss11.5统计软件进行统计学分析.

2结果

2.1乳腺癌组织与癌旁5 cm正常乳腺组织中vegf，survivin2b转录情况由于survivin2b及survivin△ex3均为survivin的剪接体，故出现三条带（图1）. vegf及survivin2b mrna在乳腺癌组织中均有较高表达，在癌旁5 cm正常乳腺组织中均低表达，差异有统计学意义（p<0.05，表1）.

1: marker; 2~11: vegf在癌旁组织的表达; 12~16: vegf在癌组织的表达. gapdh: 癌组织参考物.

图1乳腺癌组织中vegf及survivin2b的表达

表1乳腺癌与癌旁组织中vegf及survivin2b mrna的表达指标〖〗组织〖〗平均秩序〖〗表达数〖〗z*〖〗pvegf〖〗乳腺癌〖〗47.53〖〗45〖〗-2.001〖〗0.031〖〗癌旁〖〗58.42survivin2b〖〗乳腺癌〖〗45.62〖〗34〖〗-2.345〖〗0.040〖〗癌旁〖〗57.68*：数据非正态分布，采用秩和检验.

2.2乳腺癌组织中survivin及其剪接体survivin△ex3,survivin2b转录与临床病理学指标的关系淋巴结转移与vegf及survivin2b的表达相关(p<0.05)；临床病理学分期、肿块大小与标本中vegf表达相关，临床病理学分期、年龄、肿块大小与标本中survivin2b mrna表达无关（表2）.表2vegf及survivin2b mrna在癌组织中表达与临床病理学指标的关系临床病理

3讨论

vegf又称血管内皮细胞生长因子，特异性地作用于血管内皮，促进血管内皮细胞增殖，并在体内诱导血管形成. 我们发现，vegf在乳腺癌组织中的阳性表达明显高于癌旁组织(p<0.05)，乳腺癌组织中vegf阳性表达率为75％. 同时vegf的表达与肿瘤直径大小存在相关性，这与文献［2］存在不同，分析原因在于其采用的为免疫组化的方式，在计数上和观察上与rtpcr的方式存在不同. 而存在淋巴结转移者vegf的表达率明显高于无淋巴结转移者(p<0.05). 随着临床分期的升高vegf的阳性率逐渐上升(p<0.05). 这些表明vegf在乳腺癌的进展过程中起重要作用，与肿瘤的浸润转移密切相关.

生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白(inhititor of apoptosis protein, iap)家族的一个新成员，主要分布在胚胎及分化未成熟的组织，高表达于多种恶性肿瘤组织，而在终末分化的正常成熟组织中不表达［3］. 这些功能和分布特点提示生存素与肿瘤的发生、发展密切相关. 人的生存素基因有4个明显的（1,2,3和4）和2个隐藏的（2b和3b）外显子［4］. 生存素前提rna的选择性剪接生成了4个不同的剪接变体，导致相应的蛋白质结构发生显著变化［5-6］. survivin2b为survivin的一个剪接变体，其保留部分内含子2作为隐蔽的外显子，导致相应的蛋白质结构发生显著的变化，因此无抗凋亡功能甚至有负调控功能［7］；本研究中survivin2b在乳腺癌组织中的阳性表达明显高于癌旁组织(p<0.05)；survivin2b与乳腺癌患者年龄及肿块大小无特异的相关性；survivin2b与淋巴结转移相关(p<0.05). 本研究同时显示，survivin2b表达与乳腺癌患者的临床病理学分期无关.

总之，vegf及survivin剪接体survivin2b因子是乳腺癌发生、发展过程中的重要因子，与其他预后指标联合检测可望对患者的治疗以及预后作出更准确的预测.

【参考文献】
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