【关键词】 胰腺肿瘤；低氧诱导因子-1α；血管内皮生长因子
expressions of hif-1α and vegf in pancreatic cancer and their clinical significance
chen jianfeng. department of general surgery， central hospital of yiwu， zhejiang 322000
abstract objective to investigate the expressions of hypoxia-inducible factor-1 alpha (hif-1α) and vascular endothelial growth factor (vegf) in pancreatic cancer and clinical significance. methods the expressions of hif-1α and vegf in 30 cases of pancreatic cancer and corresponding pancreatic para-cancer tissues (9 cases) were studied with western blotting method. the relationship and clinical significance of hif-1α and vegf expression in pancreatic cancer were analyzed with the clinical data. results expressions of hif-1α and vegf in pancreatic cancer tissue were significantly higher than that in para-cancer tissue （p＜0.01）， and the correlative analysis revealed that the expression of hif-1α was positively correlated with vegf （r＝0.655， p＜0.01）. the levels of hif-1α and vegf were closely related with the size of tumor， the lymphnode metastasis and tnm stage. conclusion over-expressions of hif-1α and vegf were found in pancreatic cancer. hif-1α and vegf may play important roles in the carcinogenesis and aggression in pancreatic cancer. hif-1α and vegf may be a useful marker for evaluating prognosis in pancreatic cancer.
key words pancreatic neoplasms； hypoxia-inducible factor-1α； vascular endothelial growth factor
胰腺癌是人体常见的消化系统恶性肿瘤之一，恶性程度极高，预后极差。WWW.133229.cOM因其病史隐匿、解剖位置深、进展快，早期不易诊断，预后差。近几年来随着分子生物学的迅猛发展，胰腺癌是多基因相关疾病的观点逐渐被广大学者所接受。在肿瘤病理中，细胞对低氧的适应和血管生成是肿瘤发展过程中的关键步骤之一。本研究通过采用western blotting方法检查胰腺腺癌组织中低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，hif-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)的表达，分析它们之间的量效关系，并结合临床资料研究分析hif-1α、vegf与肿瘤的大小、部位、转移及临床病理分期等的关系，探讨hif-1α和vegf在胰腺癌早期诊断、侵袭转移中的临床意义。
1 资料和方法
1.1 病例资料 本实验收集2005年4月至2007年10月期间义乌市中心医院外科收集的30例胰腺腺癌手术切除的组织标本。全部病例均经手术和病理证实，术前未经化疗或放疗，具有完整的病例资料。组织标本保存于医院病理科。随机取其中9例相应的手术时取材的癌旁胰腺组织作为对照。男性16例，女性14例；年龄23~84岁，平均年龄58.8岁，中位年龄60.5岁；肿瘤大小≤2 cm 6例，＞2 cm且≤4 cm 20例，＞4 cm 4例；位于胰头部22例，位于体尾部8例；高分化腺癌6例，中分化腺癌14例，中低分化及低分化腺癌10例；淋巴结转移阴性者16例，阳性者14例；按国际抗癌联盟（uicc，1997）制定的胰腺癌tnm 分期标准ⅰ期7例，ⅱ期9例，ⅲ期11例，ⅳ期3例。
1.2 主要试剂 兔抗人hif-1α多抗、兔抗人vegf多抗、兔抗人β-actin多抗和ecl试剂盒购于santa cruz公司（美国）；鼠抗兔二抗购于dakocytomation公司（丹麦）。
1.3 western blotting 取约50 mg大小的胰腺肿瘤组织和癌旁组织，液氮下碾磨成粉末状，进行组织裂解，加入约1 ml预冷组织裂解液（10 mm tris-hcl，0.25 mm sucroce，5 mm edta，50 mm nacl，30 mm焦磷酸钠，50 mm naf，1 mm na3vo4，2% cocktail），冰上静置1 h，然后4℃低温12 000 r/min离心30 min，取上清液，bio-rad蛋白测定试剂盒（bca）测定蛋白浓度。取40 ?滋g 蛋白样品加4×上样缓冲液，100℃煮3 min变性后，行12％ sds-page， 并转移至硝酸纤维素膜，用含5％脱脂牛奶的tbs封闭，加入一抗中（trx-1和β-actin一抗均为1∶1 000稀释），摇床上反应1 h后4℃冰箱中过夜，tbst液洗膜5 min×3次，加入二抗中（抗羊、抗兔二抗均为1∶2 000稀释），反应2 h，tbst洗膜5 min×3次后作ecl化学发光，x片（kodak）曝光显影。
1.4 结果判定 x胶片置kodak凝胶图像分析软件处理， 读取目的条带和内参照β-actin的光密度值。ri为目的条带光密度值与β-actin条带光密度值的比值。ri分别反映hif-1α、vegf在癌及癌旁组织的相对表达强度。
1.5 统计学方法 所有数据的统计学处理采用spss 11.5软件。两组计量资料采用非独立样本t检验，多组计量资料采用方差分析，各组指标间的相关性采用spearman等级相关分析，hif-1α和vegf的表达相关性采用spearman双变量相关分析。检验水准以p＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 hif-1α、vegf在胰腺癌组织中的表达 见表1。结果显示hif-1α、vegf在肿瘤组织中较癌旁胰腺组织有较高的表达（p＜0.01），差异有统计学意义。
2.2 hif-1α、vegf表达的相互关系 通过对30例胰腺癌肿瘤组织标本中hif-1α、vegf表达的检测，对数据进行spearman双变量相关性分析，结果显示两者表达具有正相关关系，相关系数r＝0.655，p＜0.01。hif-1α表达水平高的病例，vegf的表达亦强；反之，vegf表达亦弱。
2.3 hif-1α、vegf的表达和胰腺癌临床病理特征的关系 结合临床病例资料进行统计分析，结果显示胰腺癌组织中hif-1α表达水平与患者性别、年龄、肿瘤部位、分化程度的关系经检验无统计学意义；而与其肿瘤大小、淋巴结转移和胰腺癌tnm分期之间有统计学意义。tnm分期显示整组资料用方差分析games-howell检验提示tnm ⅰ组与tnm ⅲ组、tnm ⅳ组，tnm ⅱ组与tnm ⅲ、tnm ⅳ组，tnm ⅲ组与tnm ⅳ组的组间差异有统计学意义（p＜0.05）。而tnm ⅰ组与tnm ⅱ组之间的差异无统计学意义（p＞0.05）。见表2。
另外胰腺癌组织中vegf的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、分化程度的关系经检验无统计学意义；而与其肿瘤大小、淋巴结转移和胰腺癌tnm分期有关。tnm分期显示整组资料用方差分析lsd法tnm ⅰ组与tnm ⅱ组、tnm ⅲ组、tnm ⅳ组，tnm ⅱ组与tnm ⅳ组，tnm ⅲ组与tnm ⅳ组的组间差异有统计学意义（p＜0.05）。而tnm ⅱ与tnm ⅲ之间的差异无统计学意义（p＞0.05）。见表3。
3 讨论
恶性肿瘤形成之初，肿瘤细胞的营养获取及废物的排出仅依靠弥散实现。当实体肿瘤直径超过1～2 mm时，弥散的方式将不能满足肿瘤存活和生长的需要。此时，如无新生血管的长入，肿瘤组织将发生退化；一旦新生血管长入，肿瘤将迅速生长，且浸润和转移的能力大大加强。folkman等[1]把这一现象称为“血管生长切换平衡(the balance for the angiogenesis switch)”。因此，在恶性肿瘤病理中，细胞对低氧的适应和血管生成是肿瘤发展过程中的关键步骤之一。hif-1是广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，是由hif-1α和hif-1β两个亚单位组成的异源二聚体核转录因子，属于bhlh-pas家族成员，其中hif-1α是主要的氧调节亚基和功能亚基[2-3]，可调节多种靶基因的表达，在肿瘤的低氧反应过程中hif-1α起着中枢纽带的作用，对维持肿瘤细胞的能量代谢、刺激新生血管生成、促进肿瘤细胞增殖和转移起重要作用[4]。zhong等[5]利用免疫组化技术对179例肿瘤标本的研究发现：在一系列人类肿瘤中，19种肿瘤中有13种hif-1α呈不同程度的表达，其中在肺癌、结肠癌、前列腺癌中hif-1α过表达占90%以上，而在相应正常组织及一些良性病变中无表达，提示hif-1α的表达与肿瘤的良恶性有明显关系。在肿瘤坏死明显的区域和肿瘤浸润的边缘，hif-1α的表达也明显增多，本研究结果显示胰腺腺癌肿瘤组织hif-1α的表达与癌旁胰腺组织差异明显，具有统计学意义（p＜0.01），说明胰腺腺癌组织中由于存在低氧的微环境，hif-1α高表达。另外结果还显示hif-1α的表达与性别、年龄、肿瘤部位、分化程度关系不明显，但是hif-1α的表达和大小、临床病理分期及淋巴结转移密切相关，提示hif-1α在胰腺癌发生发展中起着重要作用，是一个重要的预后指标。
vegf作为促血管内皮细胞强有力和特异的有丝分裂原，是肿瘤诱导产生新生血管的最主要的细胞因子之一，作用机制可能是一方面能特异性地直接作用于血管内皮细胞，与血管内皮细胞上的酪氨酸跨膜受体结合，引发一系列信号转导，刺激内皮细胞分化、增殖、迁徙和血管生成[6]。因此vegf是血管形成必不可少的因子。另一方面，vegf主要是通过实体瘤激酶插入区域受体（kinase insert domain-containing receport，kdr）而表达，提示其与肿瘤细胞上的kdr受体结合可刺激肿瘤细胞的增殖与迁移。促使肿瘤由无血管期向有血管期转变过程中，肿瘤细胞与内皮细胞存在一种双向作用，其相互释放促血管生成因子，如vegf、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、转化生长因子-β (tgf-β)、血小板衍生生长因子(pdgf)等，这些因子都能促使血管生长。内皮细胞释放的胶原酶、尿激酶、溶纤酶原激酶等则破坏基底膜，使内皮细胞移出，便于肿瘤细胞的侵袭和生长[7]。vegf在正常成人和动物中表达水平较低，但在一些代谢旺盛、血供丰富的组织中如胚胎组织、胎盘、增殖期的子宫内膜和黄体中表达水平略高，这与vegf存在可维持这些血管正常功能状态有关。然而在肿瘤组织中，vegf的表达可以增加血管内皮通透性，刺激血管形成，促进原发肿瘤的生长、浸润和转移。本研究结果同样显示胰腺癌组织vegf水平明显高于正常组织，两者比较具有统计学意义。另外胰腺癌组织vegf水平与肿瘤大小、临床病理分期和淋巴结转移程度相关， 而与性别、年龄、肿瘤部位和分化程度的关系经检验差异无统计学意义。以上结果说明vegf可促进胰腺癌血管生成、利于肿瘤细胞进入血循环并转移。因此vegf对于胰腺癌发生发展有重要意义。
胰腺癌中的vegf受到多种因素调控。胰腺肿瘤诱导血管生成，而细胞低氧是刺激肿瘤血管新生的一个主要因素。buchler等[8]证实在体内和体外条件下，低氧浓度均可使胰腺癌组织中hif-1α激活：在体内条件下，人类胰腺癌细胞中hif-1α mrna表达明显增加，同时检测出hif-1α蛋白和vegf mrna；在体外条件下，低氧浓度使胰腺癌细胞系hif-1α dna高度特异性地激活，并结合到vegf启动子上，vegf表达增加。细胞系中hif-1α蛋白含量越高，产生的vegf蛋白也相应越多。因此研究者认为hif-1α在低氧诱导的vegf基因上调中发挥关键作用。调控机制为在vegf 5′端增强子内存在hif1结合位点低氧反应元件(hre)(5′-tacgtg-gc-3′)，低氧时hif1与hre结合，可使vegf的转录和表达增强，并且低氧下rna结合蛋白与vegf的mrna 3′端富含a、u的序列结合，阻断mrna降解，增加血管生成，使血液到达低氧部位，同时还可增加低氧条件下vegf mrna的稳定性。本组实验通过spearman双变量相关分析发现，胰腺癌组织中hif-1α蛋白与vegf具有显著的正相关性，这与mohamed等[9]的结果是一致的，说明胰腺癌组织存在低氧微环境，癌细胞可产生过量的hif-1α，激活相关vegf等靶基因的激活和转录，以提高葡萄糖转运、糖酵解及肿瘤血管新生形成等体系，使之适应这一低氧环境，继续增殖、浸润和转移等恶性转化[10]。
胰腺癌恶性程度很高，与其边界不清、缺乏包膜、以浸润方式向周围扩展、具有血管性浸润和嗜神经生长的生物学特性有关。结合我们的结果可以表明，在低氧状态下胰腺癌组织中hif-1α基因的激活，与vegf的过度表达有密切关系，并可能通过调控vegf的转录而促进胰腺癌的浸润转移。因此hif-1α是胰腺癌适应低氧和诱导vegf产生的一个重要调节因素，这一肿瘤发展机制可以为今后以hif-1α基因为靶点的临床治疗和预防胰腺癌提供新的重要对策。
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