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HIF-1α、VEGF在胰腺癌组织中的表达及临床意义

2015-07-07 10:27 来源:学术参考网 作者:未知
【摘要】 目的 研究胰腺腺癌组织中的低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,hif-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,vegf)的表达情况及其临床意义。方法 采用western blotting方法 检测30例胰腺腺癌组织及其中9例胰腺癌相应癌旁胰腺组织中hif-1α、vegf的表达。结合临床病例资料,分析hif-1α、vegf与肿瘤的大小、部位、病理分化程度、淋巴结转移及胰腺癌tnm分期之间的关系。结果 统计结果显示hif-1α、vegf在胰腺癌肿瘤组织中的表达高于癌旁组织,两者比较具有统计学意义(p<0.01),同时相关性分析显示肿瘤组织中hif-1α与vegf两者之间具有正相关性(r=0.655,p<0.01)。结合临床资料分析,胰腺癌肿瘤组织中hif-1α、vegf的表达与肿瘤大小、淋巴结转移和胰腺癌tnm分期密切相关,并且具有统计学意义(p<0.01)。结论 胰腺癌组织中hif-1α、vegf存在高表达,hif-1α、vegf和肿瘤大小、淋巴结转移和胰腺癌tnm分期有关。hif-1α、vegf可能可作为判断胰腺癌预后的一个指标。

【关键词】 胰腺肿瘤;低氧诱导因子-1α;血管内皮生长因子


expressions of hif-1α and vegf in pancreatic cancer and their clinical significance

chen jianfeng. department of general surgery, central hospital of yiwu, zhejiang 322000

abstract objective to investigate the expressions of hypoxia-inducible factor-1 alpha (hif-1α) and vascular endothelial growth factor (vegf) in pancreatic cancer and clinical significance. methods the expressions of hif-1α and vegf in 30 cases of pancreatic cancer and corresponding pancreatic para-cancer tissues (9 cases) were studied with western blotting method. the relationship and clinical significance of hif-1α and vegf expression in pancreatic cancer were analyzed with the clinical data. results expressions of hif-1α and vegf in pancreatic cancer tissue were significantly higher than that in para-cancer tissue (p<0.01), and the correlative analysis revealed that the expression of hif-1α was positively correlated with vegf (r=0.655, p<0.01). the levels of hif-1α and vegf were closely related with the size of tumor, the lymphnode metastasis and tnm stage. conclusion over-expressions of hif-1α and vegf were found in pancreatic cancer. hif-1α and vegf may play important roles in the carcinogenesis and aggression in pancreatic cancer. hif-1α and vegf may be a useful marker for evaluating prognosis in pancreatic cancer.

key words pancreatic neoplasms; hypoxia-inducible factor-1α; vascular endothelial growth factor

胰腺癌是人体常见的消化系统恶性肿瘤之一,恶性程度极高,预后极差。WWW.133229.cOM因其病史隐匿、解剖位置深、进展快,早期不易诊断,预后差。近几年来随着分子生物学的迅猛发展,胰腺癌是多基因相关疾病的观点逐渐被广大学者所接受。在肿瘤病理中,细胞对低氧的适应和血管生成是肿瘤发展过程中的关键步骤之一。本研究通过采用western blotting方法检查胰腺腺癌组织中低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,hif-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,vegf)的表达,分析它们之间的量效关系,并结合临床资料研究分析hif-1α、vegf与肿瘤的大小、部位、转移及临床病理分期等的关系,探讨hif-1α和vegf在胰腺癌早期诊断、侵袭转移中的临床意义。

1 资料和方法

1.1 病例资料 本实验收集2005年4月至2007年10月期间义乌市中心医院外科收集的30例胰腺腺癌手术切除的组织标本。全部病例均经手术和病理证实,术前未经化疗或放疗,具有完整的病例资料。组织标本保存于医院病理科。随机取其中9例相应的手术时取材的癌旁胰腺组织作为对照。男性16例,女性14例;年龄23~84岁,平均年龄58.8岁,中位年龄60.5岁;肿瘤大小≤2 cm 6例,>2 cm且≤4 cm 20例,>4 cm 4例;位于胰头部22例,位于体尾部8例;高分化腺癌6例,中分化腺癌14例,中低分化及低分化腺癌10例;淋巴结转移阴性者16例,阳性者14例;按国际抗癌联盟(uicc,1997)制定的胰腺癌tnm 分期标准ⅰ期7例,ⅱ期9例,ⅲ期11例,ⅳ期3例。

1.2 主要试剂 兔抗人hif-1α多抗、兔抗人vegf多抗、兔抗人β-actin多抗和ecl试剂盒购于santa cruz公司(美国);鼠抗兔二抗购于dakocytomation公司(丹麦)。

1.3 western blotting 取约50 mg大小的胰腺肿瘤组织和癌旁组织,液氮下碾磨成粉末状,进行组织裂解,加入约1 ml预冷组织裂解液(10 mm tris-hcl,0.25 mm sucroce,5 mm edta,50 mm nacl,30 mm焦磷酸钠,50 mm naf,1 mm na3vo4,2% cocktail),冰上静置1 h,然后4℃低温12 000 r/min离心30 min,取上清液,bio-rad蛋白测定试剂盒(bca)测定蛋白浓度。取40 ?滋g 蛋白样品加4×上样缓冲液,100℃煮3 min变性后,行12% sds-page, 并转移至硝酸纤维素膜,用含5%脱脂牛奶的tbs封闭,加入一抗中(trx-1和β-actin一抗均为1∶1 000稀释),摇床上反应1 h后4℃冰箱中过夜,tbst液洗膜5 min×3次,加入二抗中(抗羊、抗兔二抗均为1∶2 000稀释),反应2 h,tbst洗膜5 min×3次后作ecl化学发光,x片(kodak)曝光显影。

1.4 结果判定 x胶片置kodak凝胶图像分析软件处理, 读取目的条带和内参照β-actin的光密度值。ri为目的条带光密度值与β-actin条带光密度值的比值。ri分别反映hif-1α、vegf在癌及癌旁组织的相对表达强度。

1.5 统计学方法 所有数据的统计学处理采用spss 11.5软件。两组计量资料采用非独立样本t检验,多组计量资料采用方差分析,各组指标间的相关性采用spearman等级相关分析,hif-1α和vegf的表达相关性采用spearman双变量相关分析。检验水准以p<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 hif-1α、vegf在胰腺癌组织中的表达 见表1。结果显示hif-1α、vegf在肿瘤组织中较癌旁胰腺组织有较高的表达(p<0.01),差异有统计学意义。

2.2 hif-1α、vegf表达的相互关系 通过对30例胰腺癌肿瘤组织标本中hif-1α、vegf表达的检测,对数据进行spearman双变量相关性分析,结果显示两者表达具有正相关关系,相关系数r=0.655,p<0.01。hif-1α表达水平高的病例,vegf的表达亦强;反之,vegf表达亦弱。

2.3 hif-1α、vegf的表达和胰腺癌临床病理特征的关系 结合临床病例资料进行统计分析,结果显示胰腺癌组织中hif-1α表达水平与患者性别、年龄、肿瘤部位、分化程度的关系经检验无统计学意义;而与其肿瘤大小、淋巴结转移和胰腺癌tnm分期之间有统计学意义。tnm分期显示整组资料用方差分析games-howell检验提示tnm ⅰ组与tnm ⅲ组、tnm ⅳ组,tnm ⅱ组与tnm ⅲ、tnm ⅳ组,tnm ⅲ组与tnm ⅳ组的组间差异有统计学意义(p<0.05)。而tnm ⅰ组与tnm ⅱ组之间的差异无统计学意义(p>0.05)。见表2。

另外胰腺癌组织中vegf的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、分化程度的关系经检验无统计学意义;而与其肿瘤大小、淋巴结转移和胰腺癌tnm分期有关。tnm分期显示整组资料用方差分析lsd法tnm ⅰ组与tnm ⅱ组、tnm ⅲ组、tnm ⅳ组,tnm ⅱ组与tnm ⅳ组,tnm ⅲ组与tnm ⅳ组的组间差异有统计学意义(p<0.05)。而tnm ⅱ与tnm ⅲ之间的差异无统计学意义(p>0.05)。见表3。

3 讨论

恶性肿瘤形成之初,肿瘤细胞的营养获取及废物的排出仅依靠弥散实现。当实体肿瘤直径超过1~2 mm时,弥散的方式将不能满足肿瘤存活和生长的需要。此时,如无新生血管的长入,肿瘤组织将发生退化;一旦新生血管长入,肿瘤将迅速生长,且浸润和转移的能力大大加强。folkman等[1]把这一现象称为“血管生长切换平衡(the balance for the angiogenesis switch)”。因此,在恶性肿瘤病理中,细胞对低氧的适应和血管生成是肿瘤发展过程中的关键步骤之一。hif-1是广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子,是由hif-1α和hif-1β两个亚单位组成的异源二聚体核转录因子,属于bhlh-pas家族成员,其中hif-1α是主要的氧调节亚基和功能亚基[2-3],可调节多种靶基因的表达,在肿瘤的低氧反应过程中hif-1α起着中枢纽带的作用,对维持肿瘤细胞的能量代谢、刺激新生血管生成、促进肿瘤细胞增殖和转移起重要作用[4]。zhong等[5]利用免疫组化技术对179例肿瘤标本的研究发现:在一系列人类肿瘤中,19种肿瘤中有13种hif-1α呈不同程度的表达,其中在肺癌、结肠癌、前列腺癌中hif-1α过表达占90%以上,而在相应正常组织及一些良性病变中无表达,提示hif-1α的表达与肿瘤的良恶性有明显关系。在肿瘤坏死明显的区域和肿瘤浸润的边缘,hif-1α的表达也明显增多,本研究结果显示胰腺腺癌肿瘤组织hif-1α的表达与癌旁胰腺组织差异明显,具有统计学意义(p<0.01),说明胰腺腺癌组织中由于存在低氧的微环境,hif-1α高表达。另外结果还显示hif-1α的表达与性别、年龄、肿瘤部位、分化程度关系不明显,但是hif-1α的表达和大小、临床病理分期及淋巴结转移密切相关,提示hif-1α在胰腺癌发生发展中起着重要作用,是一个重要的预后指标。

vegf作为促血管内皮细胞强有力和特异的有丝分裂原,是肿瘤诱导产生新生血管的最主要的细胞因子之一,作用机制可能是一方面能特异性地直接作用于血管内皮细胞,与血管内皮细胞上的酪氨酸跨膜受体结合,引发一系列信号转导,刺激内皮细胞分化、增殖、迁徙和血管生成[6]。因此vegf是血管形成必不可少的因子。另一方面,vegf主要是通过实体瘤激酶插入区域受体(kinase insert domain-containing receport,kdr)而表达,提示其与肿瘤细胞上的kdr受体结合可刺激肿瘤细胞的增殖与迁移。促使肿瘤由无血管期向有血管期转变过程中,肿瘤细胞与内皮细胞存在一种双向作用,其相互释放促血管生成因子,如vegf、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、转化生长因子-β (tgf-β)、血小板衍生生长因子(pdgf)等,这些因子都能促使血管生长。内皮细胞释放的胶原酶、尿激酶、溶纤酶原激酶等则破坏基底膜,使内皮细胞移出,便于肿瘤细胞的侵袭和生长[7]。vegf在正常成人和动物中表达水平较低,但在一些代谢旺盛、血供丰富的组织中如胚胎组织、胎盘、增殖期的子宫内膜和黄体中表达水平略高,这与vegf存在可维持这些血管正常功能状态有关。然而在肿瘤组织中,vegf的表达可以增加血管内皮通透性,刺激血管形成,促进原发肿瘤的生长、浸润和转移。本研究结果同样显示胰腺癌组织vegf水平明显高于正常组织,两者比较具有统计学意义。另外胰腺癌组织vegf水平与肿瘤大小、临床病理分期和淋巴结转移程度相关, 而与性别、年龄、肿瘤部位和分化程度的关系经检验差异无统计学意义。以上结果说明vegf可促进胰腺癌血管生成、利于肿瘤细胞进入血循环并转移。因此vegf对于胰腺癌发生发展有重要意义。

胰腺癌中的vegf受到多种因素调控。胰腺肿瘤诱导血管生成,而细胞低氧是刺激肿瘤血管新生的一个主要因素。buchler等[8]证实在体内和体外条件下,低氧浓度均可使胰腺癌组织中hif-1α激活:在体内条件下,人类胰腺癌细胞中hif-1α mrna表达明显增加,同时检测出hif-1α蛋白和vegf mrna;在体外条件下,低氧浓度使胰腺癌细胞系hif-1α dna高度特异性地激活,并结合到vegf启动子上,vegf表达增加。细胞系中hif-1α蛋白含量越高,产生的vegf蛋白也相应越多。因此研究者认为hif-1α在低氧诱导的vegf基因上调中发挥关键作用。调控机制为在vegf 5′端增强子内存在hif1结合位点低氧反应元件(hre)(5′-tacgtg-gc-3′),低氧时hif1与hre结合,可使vegf的转录和表达增强,并且低氧下rna结合蛋白与vegf的mrna 3′端富含a、u的序列结合,阻断mrna降解,增加血管生成,使血液到达低氧部位,同时还可增加低氧条件下vegf mrna的稳定性。本组实验通过spearman双变量相关分析发现,胰腺癌组织中hif-1α蛋白与vegf具有显著的正相关性,这与mohamed等[9]的结果是一致的,说明胰腺癌组织存在低氧微环境,癌细胞可产生过量的hif-1α,激活相关vegf等靶基因的激活和转录,以提高葡萄糖转运、糖酵解及肿瘤血管新生形成等体系,使之适应这一低氧环境,继续增殖、浸润和转移等恶性转化[10]。

胰腺癌恶性程度很高,与其边界不清、缺乏包膜、以浸润方式向周围扩展、具有血管性浸润和嗜神经生长的生物学特性有关。结合我们的结果可以表明,在低氧状态下胰腺癌组织中hif-1α基因的激活,与vegf的过度表达有密切关系,并可能通过调控vegf的转录而促进胰腺癌的浸润转移。因此hif-1α是胰腺癌适应低氧和诱导vegf产生的一个重要调节因素,这一肿瘤发展机制可以为今后以hif-1α基因为靶点的临床治疗和预防胰腺癌提供新的重要对策。

【参考文献】
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[8] buchler p, reber ha, buchler m, et al. hypoxia-inducible factor regulates vegf expression in human pancreatic cancer[j]. pancreas,2003,26(1):56-64.

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