作者：杨海燕，童彩玲，纪太芳
【摘要】 【目的】探讨乳腺癌患者的乳腺癌耐药蛋白(bcrp)基因表达及其与化疗疗效的关系。【方法】采用半定量逆转录—聚合酶链反应(rtpcr)的方法检测60例行新辅助化疗cef方案的女性乳腺癌患者乳腺癌组织的bcrp基因，根据化疗前bcrp基因表达情况，将60例患者分为阳性组及阴性组，比较2组间的疗效，观察bcrp基因表达与化疗疗效的关系。【结果】60例乳腺癌患者中bcrp基因阳性表达17例，阳性表达率为283%(17/60)。bcrp基因阳性组患者总缓解11例，缓解率(647%)明显低于阴性组(930%),两组比较差异有显著性意义(p<005)。【结论】bcrp 基因高表达患者采用cef方案化疗效果较差，bcrp基因的表达水平可以作为预测化疗效果的一个重要参考指标。
【关键词】 乳腺肿瘤/药物疗法;乳腺癌耐药蛋白基因;半定量逆转录一聚合酶链反应
多药耐药是影响乳腺癌化疗效果的重要因素之一，乳腺癌耐药蛋白(bcrp)是1998年被发现的又一与耐药有关的糖蛋白，其在肿瘤耐药中的作用日益受到关注。www.133229.coM本研究应用半定量逆转录—聚合酶链反应(rtpcr)的方法检测60例行新辅助化疗患者乳腺癌组织的bcrp基因表达，并观察其与化疗疗效的关系，现将结果报道如下。
1材料与方法
11病例选择60例均为我院乳腺科2005~2008年住院行新辅助化疗的女性乳腺癌患者,年龄30～65岁,中位年龄45岁。所有病例均经巴德枪粗针穿刺病理确诊，均未接受过手术、放疗、化疗、内分泌治疗等抗癌治疗的原发乳腺癌患者，并排除其他肿瘤。按照国际抗癌联盟(uicc)2002年tnm分期标准:ⅱ期27例，ⅲ期29例，ⅳ期4例。其中ⅳ期患者中1例胸椎转移，1例胸骨转移，1例肺转移，1例肝转移(以临床ct/mr诊断为标准)。按照世界卫生组织(who)乳腺肿瘤组织学类型分类标准:浸润性导管癌53例，浸润性小叶癌3例，黏液腺癌3例，髓样癌1例。
12试剂trizol试剂(invitrogen公司)，takars rna pcr kit(amv)ver30试剂盒(大连宝生物有限公司)，depc(大连宝生物有限公司)。引物光探针合成(上海生工公司)：bcrp上游引物序列为5ttaggattgaagccaaagg3’,下游引物序列为5taggcaattgtgaggaaaata3’;βactin上游引物序列为5ctcgcgc tactctctctttc3’，下游引物序列为5catgtctcgatcccacttaac3’。
13药物疗效判断标准根据化疗前bcrp基因表达情况，将60例患者分为阳性组及阴性组，并采用cef方案[环磷酰胺05 g/m2 ,第1天(d1)+法玛新80 mg/m2 ,d1+5氟脲嘧啶05 g/m2 ,d1]。21d为1个疗程，3个疗程后，按who实体瘤的近期疗效标准评定疗效，分为完全缓解(cr)、部分缓解(pr)、疾病稳定(sd)、进展(pd)。
14乳腺癌耐药基因的检测采用半定量逆转录—聚合酶链反应(rtpcr)的方法。
141rna提取肿瘤组织总rna提取采用异硫氰酸胍、酚、氯仿抽提“一步法”[1]。紫外光分光光度计准确定量，沉淀于无rnaase水中，-80℃保存备用。
142cdna合成按one step rtpcr 试剂盒(日本takara 公司) 说明书配制rtpcr 反应体系10μl, 含总rna 1μg、mgcl2 2μl、10倍rt buffer 1μl、dntp液体 1μl、rnase抑制酶 025μl、oligodt 05μl、amv酶 05μl、加入depc处理水至10μl，30℃、10min，42℃、30min，99℃、5min，5℃、5min。
143pcr反应rt产物10μl，5倍pcr buffer 10μl，ex taq酶 025μl，bcrp上、下游引物1μl(125pmol)，βactin上、下游引物1μl(125pmol)，灭菌蒸馏水2775μl置于pcr扩增仪上，反应条件为94℃、2min 预变性，然后按94℃、40s，55℃、60s，72℃、60s，共35个循环;72℃延伸10min。
144电泳取10μl pcr产物进行电泳，用20g/l琼脂糖凝胶电泳，eb染色，以5v/cm电泳60min，经凝胶成像分析系统分析扫描定量并照相，以bcrp/β2mg的比值作为bcrp基因的相对表达水平。bcrp基因电泳结果有2个条带，即bcrp 446bp及βactin 330bp，以bcrp/βactin的比值<05为bcrp表达阴性，以bcrp/βactin的比值≥05为bcrp表达阳性[1]。
15统计学方法将实验数据输入spss 100统计软件包，采用χ2检验分析阳性表达率，p<005为具有统计学意义。
2结果
21乳腺组织中bcrp mrna表达乳腺组织中bcrp mrna表达的pcr产物凝胶电泳结果见图1。60例原发乳腺癌中bcrp基因阳性表达17例，阳性表达率为283%(17/60)。
① 为marker dl2000(dna分子量标准);②为bcrp mrna表达阴性;③为bcrp mrna表达阳性
22bcrp基因表达与化疗疗效的关系表1结果显示，60例原发乳腺癌患者中，bcrp基因阳性组患者总缓解11例，缓解率(647%)明显低于阴性组(930%)，两组比较差异有显著性意义(p<005)。表12组疗效比较
3讨论
bcrp是与多药耐药相关的膜转运蛋白，主要参与膜内、外药物转运而改变药物在胞内的分布，在转运细胞毒化疗药物中以“半—转运”方式排出药物，属于atp转运蛋白的超家族成员。bcrp基因在乳腺癌中的表达情况报道结果尚不一致。本研究结果显示，60例乳腺癌中bcrp基因阳性表达17例，阳性表达率为283%。与kanzaki等[2]采用ptpcr方法检测43例初治乳腺癌患者手术切除肿瘤组织中发现9例标本有较高水平的bcrp基因表达基本相近。
肿瘤耐药是多基因参与的结果，了解耐药基因的表达，对于选择合适的治疗方案和实施有效的逆转措施具有重要的指导意义。bcrp是abc转运子编码基因家族的成员之一，该基因产物的过表达常伴有乳腺癌化疗耐药，并呈现出多药耐药性。耐药蛋白bcrp的底物广泛，bcrp表现型的耐药细胞对包括蒽环类药物、拓扑替肯(tpt)、氨甲蝶呤(mtx)、vp16等许多抗肿瘤药物耐药[3]。本研究结果表明，bcrp mrna高表达者对cef方案化疗效果较差，bcrp mrna的表达水平可以作为预测化疗效果的一个重要参考指标。因此，本项目研究的完成对临床合理地制定化疗方案、选择化疗药物的种类、避免不必要的化疗药物副作用，具有一定的指导意义。
【参考文献】
[1] 管俊，盛瑞兰，顾健急性非淋巴细胞性白血病患者乳腺癌耐药蛋白基因表达及其临床意义[j].白血病·淋巴瘤，2002，11(3)：139
[2] kaneko m,yam ori t, nakaya k,et al expression of multidrug resistancerelated transporters in human breast carcinoma[j].jpn j cancer res,2001,92(4):452
[3] doyle l a, yang w, abruzzo l v, et al a multidrug resistance transporter from human mcf7 breast cancer cells [j] proc natl acad sci usa, 1998, 95(26):15665
