(一)黄瓜的细胞遗传学研究
戚春章等(1983)通过对西双版纳黄瓜的染色体数、与普通黄瓜杂交的可育性、一代杂种的表现和过氧化物酶酯酶同功酶的观察和鉴定,证明了西双版纳黄瓜是黄瓜的一个变种。
利容千(1989)的研究表明,西双版纳黄瓜的染色体数目与黄瓜相同,但染色体的绝对长度小于黄瓜,染色体长度比、核型类别与黄瓜有较大差异,而且未显示出Giemsa带。
Ramachandrau等(1985)在分析黄瓜野生种和栽培种有丝分裂时期染色体C-带时,发现其基因组上异染色质较为丰富。同时,野生种的异染色质远远高于栽培种,他们认为这种在栽培种中异染色质的减少与驯化有关。
Hoshi等(1998)对二倍体和四倍体黄瓜染色体的分析发现,其体细胞染色体数分别为2n=14和28。单倍体染色体由5条等臂染色体和2条亚中间着丝粒染色体组成。所有染色体均有清晰可见的C带。单倍体具有C带染色体的长度占染色体总长度的。染色体1、2、4、5和7具有稳定的C带。3条粗大的C带位于染色体1和2的最接近区域。染色体1上的C带长度占短臂长度的。染色体2上的C带位于着丝粒附近,占该染色体全长的,在早中期有伸长的主缢痕。在前中期,染色体2的长臂和短臂完全分离。在中期细胞中,不能观察次缢痕的数量。但是,在单倍体植株中,6条染色体似乎有次缢痕。在2条大染色体的主缢痕处可以观察到两条银染带。
陈劲枫等(2003)认为野黄瓜Cucumis hystrix(2n=24)是在亚洲发现的第一个染色体基数为12的黄瓜属物种。这一发现对现行的以染色体基数和地理分布为基础的黄瓜属分类系统提出了质疑。
曹清河等(2004)以南方型和北方型两个生态型黄瓜为材料,用改良的染色和制片方法,较为系统地研究了黄瓜花粉母细胞(PMC)减数分裂及其雄配子体的发育过程。结果表明:黄瓜减数分裂属于同时型胞质分裂,双线期染色体具有明显的交叉节并呈现出较易识别的棒状或环状形态,在末期Ⅰ和末期Ⅱ有多核仁和核仁融合现象;在四分体时期的小孢子成十字交叉形(decussate type),而非四边形(isobilateral type);雄配子体发育过程中观察到两核居中期的特殊现象,在核居中期小孢子只有一层壁,而在核靠边期小孢子出现了两层壁;黄瓜的成熟花粉粒属于两核花粉粒。
(二)黄瓜分子水平的遗传多样性与分类研究
20世纪90年代中期前,关于黄瓜的分子遗传多样性分析主要以同工酶标记为主。但标记数量只有18个,且多态性很低,不能区分黄瓜各栽培品种。其后RFLP、AFLP、SSR等DNA标记技术陆续在黄瓜上开始应用。
Esquinas-Alcazar(1977)、Staub等(1985c)都曾分别利用同工酶研究黄瓜的亲缘关系。尽管黄瓜同功酶的遗传变异较小,但Knerr等(1989)用代表74个生化位点的40种酶对美国收集保存的757份来源于45个国家的黄瓜种质的遗传多样性进行了评价,在18个位点观察到了多态性。Meglic等(1996a,1996b),Staub等(1997,1999)先后对美国国家种质库保存的黄瓜资源和后来从印度和中国收集或引入的资源进行了21个同功酶位点的多态性的比较分析,在明确不同来源黄瓜种质资源的特点和关系的同时,认为印度和中国的黄瓜种质互不相同,而且也不同于其他来源的黄瓜种质,中国和印度的黄瓜种质资源代表了美国黄瓜收集品中最多样的遗传变异。
Dijkhuizen等(1996)利用RFLP标记评价两组黄瓜种质的遗传多样性。在第一组16个品系中,RFLP标记反映了与同工酶分析一致的品种间的亲缘关系;在第二组35个栽培品种中,RFLP分析揭示了与形态(果形)及实际系谱关系相一致的品种间的亲缘关系,认为RFLP可用于黄瓜分类和遗传多样性分析。
张海英等(1998)对34份分别来自美国、日本、英国和中国的黄瓜材料作了遗传亲缘关系的RAPD分析。从200个10碱基的随机引物中筛选出20个用于PCR反应,共获得130条扩增带,其中51条表现多态性;每个生态型品种都具有其特有的扩增(或缺失)条带以区别于其他生态型品种,聚类分析成功地将供试材料分为三类:类群Ⅰ为华北类型;类群Ⅱ为华南类型与欧洲露地型;类群Ⅲ为欧洲温室型。其分析结果显示:黄瓜基因组中有大量相同的DNA序列,是一种遗传变异幅度较小的植物;尽管如此,RAPD技术仍然能够成功的对其进行聚类分析,验证了RAPD对黄瓜聚类的可能性,同时认为一些引物所产生的特有缺失和特异条带可作为某些类型的特异条带。
李锡香等(2004)利用29个引物对66份来源和类型不同的黄瓜种质基因组DNA的RAPD分析,共扩增出了253条带,其中195条为多态性带,比例为。不同引物所揭示的种质多样性差异很大。供试种质间平均期望杂合度为。中国黄瓜种质的平均期望杂合度为,略高于国外引进种质。长江以南黄瓜种质的遗传多样性高于长江以北,华南型种质的遗传多样性高于华北型种质。长江流域以南可能是黄瓜的较早或主要的演化地。供试种质依RAPD标记被分为8个组群。西双版纳黄瓜明显地与其他栽培种质分开了,国外引入的绝大多数种质被聚到一起或分属单独组群。除西双版纳黄瓜外,其他中国黄瓜栽培种质的遗传关系与形态特征和地域分布虽然存在一定的相关性,但不总是一致,表明地区间的引种交流可能导致了某些基因在不同种质间的渗入。
Horejsi和Staub(1999)对180个黄瓜材料进行RAPD分析,得到的遗传距离在~之间,认为黄瓜的遗传背景较窄。RAPD的聚类结果与RFLP的相似,同时,获得的71个多态性位点可把每个品种都区分开来,证明RAPD方法对黄瓜遗传多样性的分析和区分黄瓜不同的基因型是有效的。
庄飞云等(2003)从220个随机引物中筛选出31个对23份黄瓜属材料,包括黄瓜栽培种、黄瓜野生变种、近缘野生种、种间杂交种及其与黄瓜回交自交的后代以及甜瓜进行亲缘关系的分析。以遗传距离为阈值,23份材料被聚类为黄瓜栽培种、近缘野生种、种间杂交种和甜瓜亚属种4类。RAPD的分析结果表明,野生种与黄瓜栽培种的遗传距离近于甜瓜,该结果与同工酶分析结果一致。
Truksa(1996)的研究证明RAPD的低多态性难以在验证杂交种子的杂交性上发挥作用。
Katzer等(1996)用SSR研究了不同葫芦科蔬菜品系的多态性,7个SSR中的4个可检测出11个黄瓜品系的多态性。证实了SSR在黄瓜中存在多态性。Danin-Poleg(2000)使用来自甜瓜的48个和来自黄瓜的13个共计61个SSR对甜瓜和黄瓜进行遗传多样性的研究,其中53个显示多态性。利用其中的40个SSR(30个来自甜瓜,10个来自黄瓜)对11个供试黄瓜品种进行多态性分析,26个SSR扩增出产物(10个黄瓜SSR,16个甜瓜SSR),其中19个SSR(8个黄瓜SSR,11个甜瓜SSR)显示良好的多态性。11个黄瓜供试品种被明显聚类为栽培黄瓜和野生黄瓜两类(遗传距离)。而10个栽培黄瓜品种内聚类距离小于,未能显示足够的多态性,因此进行黄瓜栽培品种内的遗传多态性分析还需结合其他分子标记及更多的SSR标记。
陈劲枫等(2002)通过RAPD标记分析表明,在所选的21个随机引物中,15个引物(占71%)显示出栽培黄瓜(Cucumis sativus L.,2n=14)与酸黄瓜( Chakr.,2n=24)正反交之间的差异;其中一些条带表现出父性遗传现象。陈劲枫等(2003)采用SSR和RAPD两种分子标记对黄瓜属22份不同类型材料的亲缘关系进行了研究。结果表明,野黄瓜与黄瓜 (2n=14)间的遗传距离(SSR:,RAPD:)小于其与甜瓜 (2n=24)间的距离(SSR:,RAPD:)。SSR计算的各物种间遗传距离值高于RAPD的结果,线性方程为y=,但两者相关性较好,r=。综合109个SSR位点和398个RAPD条带对22份材料进行聚类分析,共分为两群:CS群(黄瓜、西南野黄瓜 、及野黄瓜)和CM群(甜瓜、菜瓜 、野生小甜瓜 及非洲角黄瓜)。
顾兴芳等(2000)对AFLP技术在黄瓜种质资源鉴定及分类上的应用进行了初步的探索。分析了国内外的15份品种,将它们分为两大类群和一个特殊类型:华北类型、欧美露地型和一个特殊的以色列Kessem品种。AFLP在黄瓜上显示的多态性高于RAPD。
李锡香等(2004)采用AFLP分子标记技术,对中国黄瓜种质资源遗传多样性及其与外来种质的关系进行了分析,结果表明,8对AFLP引物在70份黄瓜种质中共扩增出425条带,多态性带的比例为66%。供试黄瓜种质的平均期望杂合度为,中国种质的平均期望杂合度为,明显高于国外种质的。西双版纳黄瓜和印度野生黄瓜具有一些栽培种质没有的特异位点,中国栽培种质的特异位点多于外来栽培种质,后者也有一些中国栽培种质没有的特异位点。聚类分析将70份种质分为三大组群,即西双版纳黄瓜(Cucumis sativus Qi et Yuan)组群, 野生黄瓜组群和栽培黄瓜组群。西双版纳黄瓜与栽培黄瓜的距离最远,与野生黄瓜次之。按一定的遗传距离可以将中国和外来栽培种质分开。大多数华南型和华北型种质归属于不同的亚组。这些结果有助于有目的地利用这些变异拓宽育种材料的遗传背景。
各种分子标记在栽培黄瓜上显示的多态性较低。如RFLP的多态性标记比率为33%(Dijkhuizen等,1996)。RAPD的多态率为64%(Kennerd等,1994)。说明黄瓜栽培品种的遗传基础比较狭窄。野生黄瓜则具有栽培黄瓜所没有的性状和位点,在育种中具有较高的利用价值(李锡香,2002)。
(三)黄瓜连锁图谱的构建
Pierce等(1990)对自20世纪30年代以来发现的黄瓜已知性状的基因进行了总结和分类,并根据相关文献数据又构建了一张含有42个黄瓜标记性状、6个连锁群的经典遗传连锁图。显然6个连锁群并没有与黄瓜染色体一一对应,其中连锁群Ⅰ最大,有12个基因;而连锁群Ⅳ最小,只有2个基因。还有一些基因没有被定位在这些连锁群中。该图谱来自之前的基因连锁研究数据分析整合,由于基因定位所依据的群体无法确定,使得图谱的精确度降低,一些基因位点的间距以及图谱总长度无法确定。
Ramachandran等(1986)研究认为:黄瓜在减数分裂过程中每对染色体将有次交换,每次交换约占基因组长度50cM,黄瓜基因组长度大约为742cM(交换/对染色体×7对染色体×50cM/交换)。Staub(1993)认为黄瓜的基因组长度是750~1000cM,因此一个饱和的黄瓜连锁图谱应包含至少1000个左右的标记。
研究者们先后利用各种标记,构建了多张黄瓜遗传图谱,Lee等(1995)利用RAPD在黄瓜的杂交F2群体中发展分子标记,获得具有28个RAPD标记的黄瓜分子连锁图谱。
Fanourakis等(1987)利用F2和形态学标记构建了4个连锁群,图谱长度为168cM,涉及13个形态标记,标记间平均间距。Vakalounakis(1992)发现了一个隐性叶型突变基因,并与其他的表型标记进行连锁分析,构建了具4个连锁群的遗传图谱,涉及11个标记,覆盖基因组长度95cM。Knerr等(1992)利用同工酶标记构建的图谱长度为166cM,由18个同工酶标记组成,相互连锁组成4个连锁群。Kennard等(1994)利用分子标记(RAPD、RFL P)、同工酶、抗病性和形态学标记在一个遗传背景宽和窄的群体中构建的图谱长度分别为766cM和480cM,前者有58个位点,分属10个连锁群,该图谱标记间平均距离约为21cM。后来,Meglic等(1996c)又利用同工酶和形态学标记构建的图谱长度为584cM,将同工酶的标记增加到21个。Serquen等(1997)以栽培品种间杂交后代群体,使用1520个RAPD引物和形态学标记进行了连锁图谱的构建,共产生180条多态性带,73个引物标记出80个位点。在构建的9个连锁群中有77个RAPD标记、3个农艺性状(F,de和ll)。标记间平均距离为±,覆盖了600cM。Staub等(2000)利用JoinMap v 110软件,将前6张黄瓜遗传图谱进行了图谱整合研究,最后整合成一个具有134个位点的连锁图谱,图谱长度431cM,两个标记间平均间隔。随着RAPD,RFLP,SSR,AFLP等DNA标记的出现和使用,Staub实验室构建的黄瓜标记连锁图谱有了很大发展。该小组完成的Park图谱所定位的RFLP,RAPD,AFLP的标记总数达到353个,覆盖了的黄瓜基因组。与Kenard图谱相比,某些相同标记在两图谱上的位置存在差异(Park等,2000)。与Staub实验室合作完成的Danin-Poleg图谱在Kenard图谱基础上新增14个SSR标记、39个RAPD和同工酶标记,定位标记121,其中RFLP标记62个、RAPD标记36个、SSR标记14个、同工酶标记5个及形态和抗性性状4个,覆盖基因组长度,标记平均间距(Danin-Poleg等,2000)。Bradeen等(2001)公布的最新连锁图谱由于AFLP标记的使用使得标记间的平均连锁距离缩短到。
李效尊等(2004)利用侧枝长势强、全雌性、欧洲温室型黄瓜自交系S06和侧枝长势极弱、强雄性自交系S52的栽培品种间杂交F2代群体,构建了黄瓜的随机扩增多态性DNA(RAPD)分子遗传框架图谱,并定位了侧枝性状基因(lb)和全雌基因(f)。图谱中共包括79个RAPD标记,分属9个连锁群,总长度,平均间距为。侧枝基因(lb)定位在一个大的连锁群上,其两侧标记是OP2Q521和OP2M2222,与lb的间距分别是和。全雌性基因(f)定位在一个小的连锁群上,其两侧标记是OP2Q522和BC151,与f的间距分别是和。
张海英等(2004a)以黄瓜栽培品种的重组自交系为材料,采用AFLP、SSR、RAPD分子标记,构建了包含9个连锁组群,由234个标记组成的连锁图谱,其中包括141个AFLP标记、4个SSR标记和89个RAPD标记,覆盖基因组,平均图距。至此,构建的遗传图谱长度为166~,平均标记间隔为~。
目前已经发表的黄瓜各类形态学基因总数已经达到132个(Wehner,1997;Xie等,2001),在图谱中被定位的基因有52个,与重要经济性状紧密连锁的标记尚少(张海英等,2004a)。
目前被标记的园艺性状基因有雌性系(F)、有限生长(de)、小叶片(ll)。被进行QTL分析的园艺性状包括性别表达、主干长度、侧蔓数量、花期、果数和果重、瓜长和瓜径、瓜长/瓜径的比值。
陈劲枫等(2003)利用RAPD技术对黄瓜性别特异基因进行分子标记连锁研究。共选用300个10碱基的随机引物,按BSA法对黄瓜性别表型分离群体进行PCR扩增,筛选出5个在全雌和弱雌株基因池(gene pool)中表现多态性的引物。单株检测表明,引物B11具有全雌特异性,在检测的大多数全雌性单株中均可扩增出一条约1000bp的特征带。而在雌雄同株的单株中则未见。因此,将该全雌性特异的片段命名为B1121000。该标记的获得为黄瓜性别特异基因的分离和克隆奠定了基础。另外,以ACC合酶基因(CS2ACS1)特异引物检测分离群体单株,发现该酶基因存在于所有性型的单株中,不具有性别特异性。娄群峰等(2005)以F2性型分离群体为材料,利用BSA法和AFLP引物EcoRI-TG+MseI-CAC筛选出了一条分子量为234bp的特异带,该标记与全雌性位点的连锁距离为。
张海英等(2004b)以叶面积增长量为鉴定指标,对黄瓜耐弱光性状进行了研究。在234个分子标记位点组成定位了5个叶面积增长量的QTL,每个QTL的贡献量在~之间,其中1个QTL显示正效加性效应,4个QTL显示负效加性效应。
Serquen等(1997)对黄瓜园艺性状进行了QTL分析。发现标记BC-551和BC-592与ll位点分别相距和;OP-L18-2与de相距16cM。在两个试验点鉴定出了5个与性别有关的QTLs,效应最大的QTL位于B连锁群上,与F位点相连,解释了该性状变异的。5个控制主茎长度的QTLs中,效应最大的QTL位于B连锁群上,解释了表型变异的39%~45%。3个与单株分枝数有关的QTLs中,1个两试验点共有的QTL位于B连锁群上,解释了表型变异的40%和37%。控制开花天数的3个QTL均位于B连锁群上,单个位点最大表型效应为。控制果数的4个QTL的单个位点最大效应为。与果重有关的4个QTL的单个位点解释的最大表型方差为。控制果长的1个QTL解释的表型方差为~。与果径有关的4个QTL中效应最大的QTL解释的表型方差为。
Serquen(1997)使用RAPD技术对黄瓜进行了园艺性状的QTL分析。在5个与性别表达有关的QTL中,贡献最大的一个QTL在连锁群B中与F位点相连[Serquen 和Staub(1997)]。
被研究的抗病基因有番木瓜环斑病毒西瓜小种(PRSV-W)的抗性基因(Prsv-2)、小西葫芦黄化花叶病毒(ZYMV)的抗性基因(zym)和霜霉病的抗性基因(dm)。
Park(2000)对Prsv-2和zym两种抗性位点(分别抗PRSV-W和ZYMV)进行标记筛选,发现Prsv-2和zym相距,找到了一个与zym共分离的AFLP标记,E15/M47-F-197;另有3个AFLP与zym以连锁。标记dm的研究比较多见,但是,大多距离较远。在Horejsi(2000)所筛选到的几个RAPD标记中,BC519连锁最紧密,遗传距离是;而Kennard(1994)也曾获得过一个连锁距离为的RFLP标记。
张桂华等(2004)利用F2群体和BSA法,通过P18M47引物获得了与黄瓜抗白粉病基因紧密连锁()的两个特异片断238bp/236bp。