(一)通过远缘杂交创新种质
黄瓜(Cucumis sativus L.)与甜瓜( L.)的种间杂交长期以来很受人们重视,因为甜瓜具有黄瓜所缺乏的对某些病原体的抗性。如果杂交成功,将极大地丰富黄瓜的基因。但在栽培黄瓜与甜瓜及其野生种之间的杂交很难成功。Ondrej等报道(2001),由于受精后的障碍,栽培甜瓜和黄瓜正反交杂种的胚只能发育到球形胚阶段。由于体细胞的不亲和性,甜瓜×黄瓜的体细胞杂种细胞在愈伤组织阶段就停止了分裂(Jarl et al.,1995)。迄今为止,国内外研究者对黄瓜属两个栽培作物之间的种间杂交还未取得成功。关于黄瓜属栽培作物与野生种之间的种间杂交,大多数的杂交只进行到胚这一阶段。除了Chen等(1997,1998)的报道外,其他关于获得种间可育F1的报道都难以重复。
Chen等(1997)首次报道了采用胚胎拯救方法,利用野甜瓜(Cucumis hystrix Chakr.)(2n=2x=24)与栽培种黄瓜进行种间杂交获得成功,且得到了不育的后代(2n=19)。为了恢复育性,在正反交的基础上,应用体细胞无性系变异(somaclonal variation)通过进行染色体加倍,经过育性恢复筛选,获得了一种有商业开发前景的甜瓜属双二倍体新种质(Chen et al.,1998)。新种质被定名为Cucumis hytivus(Chen and Kirkbride,2000),其基因组为HHCC(H和C分别代表和的基因组),染色体数为2n=4x=38。新种质在露地和温室都表现出旺盛的结果能力,每株可结果30个左右,常常2~3个果结在同一节上,果型整齐,可一次采收,适用于腌制类型黄瓜品种的选育。果实细长,基本无种子,果重约50~100g,果长约10cm,果型指数;嫩果绿色,除黄瓜味外还稍有柠檬味,蛋白质和矿物质的含量分别为和,均分别高于普通黄瓜含量和。同时,新种质抗白粉病,对南方根结线虫的抗性介于野生种酸黄瓜和栽培黄瓜之间,当杂种作为供体亲本与栽培黄瓜进行回交时,抗性被进一步转移到回交一代中(陈劲枫等,2001)。新物种的光补偿点为μE/(m2s),低于以往报道的耐弱光品种长春密刺。弱光处理2周后,新种的叶绿素a和叶绿素b含量增加,叶绿素a/b的值大幅度降低,形态学耐弱光隶属值高达,说明杂交新种耐弱光能力很强(钱春桃等,2002)。
表15-5 甜瓜属栽培种和野生种的种间杂交
陈劲枫等(2003)将种间杂交获得的异源三倍体与栽培黄瓜北京截头杂交,经过胚挽救获得了两个2n=15(14C+1H)的单体附加系02-17和02-39。前者植株叶形为掌状形,后者为深陷的掌状形,并且果实均为白色,不同于异源单倍体的掌状心脏形和黑刺,果形比异源三倍体黄瓜更长接近普通黄瓜。细胞学和RAPD分析发现,上述附加系附加了野生种Cucumis hystris的染色体。
(二)通过种内杂交创新种质
黄瓜属变种间的基因交流比种间容易得多。黄瓜的野生变种与普通栽培种相互杂交可育,因此,多年来国内外育种家一直致力将野生变种中的分枝性强、结果数多、高抗某些病虫害等优良基因转移到栽培品种中。
Deakin等(1971),Staub和Kupper(1985a)都曾采用野生黄瓜( )与栽培黄瓜杂交的方式创造新的种质。野生黄瓜的一个株系LJ90430比栽培黄瓜植株大,侧枝多,种子小,具短日照习性,在北加州秋季气候条件下,LJ90430株系通常每株能产约80个成熟果实(Horst and Lower,1978)。该株系被广泛运用在育种计划中,并且先后获得了一系列具有改良性状的优异种质(Staub,1985b,1992;Peterson,1986)。
Walters等(1997)利用野生资源LJ90430与栽培种质杂交、回交和自交,创新出了抗北方根结线虫和爪洼根结线虫的系列种质NC42~NC46。
Simon 等(1997)以美国种质SMR18为母本,西双版纳黄瓜为父本,进行回交,选择果肉颜色深的半姐妹系,通过3代的姐妹交和混合选择,获得后代材料104,后继续姐妹交和选择,获得了新种质LOM 404,其胡萝卜素含量最高可达15mg/kg。以美国种质Addis为母本,西双版纳黄瓜为父本,进行回交,通过3代的姐妹交和混合选择,获得后代材料101,用104与101杂交后,经连续五代自交单株选择和一代混合选择获得新种质EOM 400和EOM 402;其胡萝卜素含量高达25mg/kg(图15-10、15-11)。
图15-10 高胡萝卜素黄瓜种质的创新
图15-11 高胡萝卜素黄瓜种质LOM 404的4个成熟果实的纵切面
国内外黄瓜育种家,利用对各自掌握的种质资源,通过类型或品种间杂交,育成了大批抗病、抗逆、优质、高产、熟性各异的自交系和雌性系,促进了黄瓜品种的杂优化。例如,卓齐勇等(1988)于1975年从引进的早龙和黑龙第二代植株中发现全雌株、强雌株和普通株3种类型。早代利用强雌株的雄花授予全雌株的雌花上,晚世代结合赤霉素诱雄和自花授粉,选育出全雌株率达到~100%的雌性系奥早和黑龙选。之后,利用回交转育的方法,以奥早和全青为亲本,以优质抗霜霉病的全青为轮回亲本,连续回交3~4次获得全青的优良性状,然后在经过2~3代自交,获得一系列雌株率在90%以上的优良雌性和强雌性株系,其中奥早75和奥早82为优质、早熟、抗病的雌性系。1995年,卓齐勇等又用82雌性系作母本,大悟大吊瓜作回交亲本,进行杂交并回交一次,经过7代的抗病性筛选,选育出抗疫病、霜霉病、炭疽病、细菌性角斑病等5种病害的82大雌性系。尹彦、李锡香等利用国内外不同类型的黄瓜种质通过杂交、添加杂交和系统选育创新出全雌性和复雌性黄瓜新种质G5224和EF1613。G5224是由国外品种Branex(F1)的自交分离群体所选单株与北京刺瓜的自交系(S5)杂交,经多代系统选择得到优良自交系后,又与引自美国的5207杂交,再经多代系统选择而育成。该自交系结合了北京小刺、欧洲品种和美国品种的优点,表现全雌性、早熟、坐果率较高,果实商品性好,瓜长30cm左右,瘤刺大小和稀密中等,瓜色深绿,有光泽,无黄色条纹,心室较小。植株耐低温,苗期在10℃和3000lx光照条件下处理15d后幼苗成活率为,比对照新泰密刺高,抗角斑病、枯萎病、黑星病、白粉病,耐霜霉病和灰霉病。EF1613是以编号为 373/85的国外黄瓜品种与北京刺瓜杂交,经4代纯化选择,得到优良株系后,又与来自东北地区的一个地方品种8970杂交,经过多代选择,最终形成EF 1613品系。该品系长势强健,雌花多,坐果率较高,以主蔓结瓜为主,侧蔓数量不多,果实商品性好,瓜长30cm左右,瘤刺大小和稀密中等,瓜色深绿,有光泽,无黄色条纹,心室较小。植株高抗黑星病,抗角斑病、枯萎病、白粉病,中抗根结线虫,耐霜霉病。利用上述优异种质,培育出雌性和强雌性黄瓜杂交一代系列中农202、中农203、中农208等。
利用常规方法进行种质改良的研究较多,在此不再赘述。
诱变育种就是利用物理因素(如X射线、γ射线、紫外线、激光等)或化学因素(亚硝酸、硫酸二乙酯等)来处理生物,使生物发生基因突变。从而在短时间内获得更多的优良变异类型的育种方法。
陈劲枫等(2004)利用的秋水仙碱浸萌动的黄瓜种子,染色体加倍率可达。与原二倍体相比,同源四倍体的侧枝数减少,叶柄变短,叶面积增大,花器变大,果型指数减小。四倍体花粉的可染率和萌发率均显著降低。
雷春等(2004)通过辐射剂量为200 Gy或300 Gy的C射线辐射花粉授粉并结合胚培养,从3个基因型黄瓜中获得了单倍体植株。与正常二倍体植株相比,单倍体植株生长缓慢,花器异常。研究同时发现辐射剂量、亲本基因型、授粉组合对坐果率和单倍体产率有一定影响。
图15-12 黄瓜自交系CHA03210搭载前后植株叶片变异
搭载前后叶片大小 搭载后部分自封顶(引自余纪柱等,2007)
李加旺等(1997)利用/kg60Co γ射线辐射处理具有某些优良特性的黄瓜自交系种子,并在其变异后代群体中,筛选出两个综合性状优良的单株。经3代系选,从中分选出一个主要性状均能稳定遗传的株系辐M-8。该株系集几种优异性状于一体,用其为亲本与另一高代自交系配制出适于日光温室栽培的耐低温、弱光杂交一代组合:93-黄瓜新品系。
图15-13 黄瓜自交系CHA03210搭载后变异株自交后代果实的变异
陈劲枫等(2004)在室温条件下,用、、的秋水仙素水溶液分别处理黄瓜津绿4号干种子和萌动种子。结果表明,的秋水仙素浸萌动种子4h的染色体加倍效果最好,加倍率可达。与原二倍体相比,同源四倍体的侧枝数减少,叶柄变短,叶面积增大,花器变大,果型指数减小。四倍体花粉粒大小不一,每一朵花中平均有的4孔花粉粒;四倍体花粉的可染率和萌发率均显著降低。
航天诱变是诱变的一种特殊形式,是利用卫星或高空气球携带、搭载植物种子等生物体样品,经特殊的空间环境条件(强宇宙射线、高真空、微重力等)作用,引起生物体的染色体畸变,进而诱发生物体遗传变异,经地面种植选育试验后,能快速而有效地育成作物的新品种(系),供生产上推广利用,可广泛应用于各种植物的遗传改进。这种技术也为黄瓜种质创新开辟了新途径。余纪柱等(2007)利用卫星搭载黄瓜自交系材料,通过地面种植、观察,当代植株即发生了叶片大小和株型自封顶变异,经过自交分离,后代果实大小、果形指数、雌花节率和每节雌花数发生较大变异,经纯化获得特小型黄瓜自交系CHA03-10-2-2。该自交系瓜长8cm左右,雌花节率达,表现稳定,可直接用于培育特小型黄瓜新品种。
(四)利用细胞工程和基因工程创新种质
细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学方法,借助工程学的试验方法或技术,在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性,以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术,狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。植物细胞工程包括:植物组织、器官培养技术,细胞培养技术,原生质体融合与培养技术,亚细胞水平的操作技术等。目前,细胞工程技术在黄瓜种质创新中的应用主要集中在大孢子培养、原生质体培养和体细胞融合等方面。
据杜胜利(2004)介绍,天津科润黄瓜研究所“利用分子标记和单倍体技术创造黄瓜育种新材料研究”项目通过了天津市科委组织的技术鉴定。该项目通过对黄瓜雌核发育机制研究、黄瓜离体雌核发育培养体系、黄瓜染色体倍性鉴定及加倍技术研究,建立了一套高效、稳定的黄瓜未受精子房培养的技术体系,再生频率达25%。研究和建立了一套简单、快速而有效的倍性鉴定方法,筛选出诱导黄瓜单倍体、双单倍体染色体加倍的有效办法,加倍频率达。据孙日飞(2005)的进一步介绍,黄瓜大孢子培养以开花前2~3d为接种的最佳时期,以Miller为基本培养基,以AD或ADS为细胞分裂素,以蔗糖为首选糖源。无菌材料经横切或纵切后,接种至诱导培养基三角瓶中,后转至培养室培养:并以25℃黑暗条件培养7d,然后移至等温度14h/10h(光照/黑暗)条件下培养为最好。该技术已基本成熟,并已以此培育出了植株。
黄瓜由子叶、真叶和胚性悬浮培养细胞等材料的原生质体培养已成功(吕德扬等,1984;刘少翔等,1991,贾士荣等,1985,1988;Punja等,1990),但是再生植株相对困难。
为了获得再生植株,张兴国等(1998a)对黄瓜原生质体分离和再生条件的研究表明,7日龄初展黄瓜子叶和15~17d的真叶,在1%纤维素酶、离析酶和~/L甘露醇混合酶液中,均分离出大量原生质体,转入附加1mg/L BA和/L 2,4-D的改良KM培养基(去除NH4NO3)中浅层液体培养,形成微愈伤组织。由成都二早子黄瓜真叶原生质体愈伤组织培养的胚状体和子叶原生质体愈伤组织诱导的不定芽,都培育出了小植株。
张兴国等(1998b)将黄瓜子叶原生质体来源的愈伤组织在/L BA和/L NAA的MS固体培养基上再生绿苗,经生根成为完整植株。10μg/ml诺丹明6G(R6G)处理15min或/L碘乙酸(IOA)处理10min,均能有效地抑制黄瓜原生质体分裂。分别经R6G和IOA生理性失活的原生质体经PEG和高钙高pH法融合后可恢复分裂生长。由4个黄瓜种内组合得到了愈伤组织。部分愈伤组织分化了根,部分愈伤组织经酯酶同功酶分析确定为体细胞杂种。
基因工程技术在黄瓜种质创新中的应用也有了一些进展。国内报道了采用介导外源DNA的方法改良黄瓜种质的试验。邓立平等(1995)曾报道以抗霜霉病津研4号黄瓜为供体,丰产感病黄瓜长春密刺为受体,于人工辅助授粉后12~24h,采用微注射法通过柱头将外源DNA注入受体子房,从而导入了外源基因,获得了稳定的突变新品系CJ90-40。
邹长文(2004)将冷诱导基因cor15a基因和转录因子CBF3基因同时导入黄瓜基因组,并通过了植物基因组DNA的PCR检测和Southern杂交检测。PCR检测结果表明有4株植株携有cor15a基因,有3株植株携有CBF3基因,其中只有2株携有双基因。转基因植株的Southern杂交结果证明两株携有双表达盒的转基因植株中,其中1株的目的基因拷贝数为2,另一株为1个拷贝,证明目的基因已经导入黄瓜基因组中。