质粒提取及纯化研究论文

质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子。小鼠没有叶绿体，你可以直接参照小鼠线粒体的提取方法进行提取。

不知道楼主你说的对照组，做的是阳性对照，还是阴性对照呢？如果这个不说清楚，是没法回答你的问题。假设，你说的对照是阴性对照的话，首先第一个，1，这个结果就是不对的，对照组出现菌落，说明你的抗生素失效了，实验无效。2.的话说明你的转化没有成功，实验操作跟试剂没问题3.实验成功，可以挑取单克隆摇菌假设你说的对照组做的阳性对照那么1.实验成功，可以进入下一步2.试剂或者操作有问题，导致阳性对照都做不出来3.这个实验结果没法接受，不合常理，重新再转化另外，一般做转化，会正反对照都做，阳性对照+阴性对照。

传统的质粒提取方法前面人已经回答挺全了，现在实验室讲究效率，很多都直接使用试剂盒的，例如BIOG的质粒提取试剂盒，有小量、中量的、高纯的，还有专门去内毒素的等等，可以满足大部分实验需求。

本文主要以OMEGA试剂盒（产品编号#D6950）为例，讲述下提质粒（去内毒素）的注意事项。 DNA在化学性质上是懒惰的，但是在物理结构上是易碎的。因为在化学上其潜在的反应基团隐藏在中央螺旋部位，并经氢键紧密连接，同时碱基外侧受磷酸键和戊糖形成的强大环层的保护，这种保护因内在的碱基堆积力而进一步加强；在物理上，其长而弯曲，侧面不稳定，更容易受到柔和剪切力的破坏。双链DNA在溶液中随机卷曲，并由于碱基之间的堆积作用和DNA骨架上磷酸基团之间的静电排斥力而变得粘稠，所以在移液、震荡或搅拌引起的液流中，在粘滞的盘绕物上产生的拖拉力，很容易切断双链DNA。DNA越长，破坏其所需的力越小，大于150kb的DNA分子在常规分离基因组DNA过程中易于断裂。 一般DNA分离提纯可以简单分为三步： 裂解宿主细胞。如， 离子去污剂，如SDS 从细胞中释放DNA，去除与DNA结合的蛋白质并快速使胞内核酸酶失活。如， 酶水解蛋白和RNA 层析液中吸收、释放DNA 利用乙醇或者异丙醇沉淀DNA去除盐离子。 菌液在高PH条件下，加入强离子去污剂（如，SDS）能够破坏细胞壁，是蛋白质与染色体DNA变形，并将质粒DNA释放到上清液中。但是在实验中关键是动作要快，因为长时间暴露在变形条件下会对闭环DNA造成不可逆性。这种变性的折叠卷曲DNA不容易被限制性内切酶切割，它的琼脂糖电泳速率是线形、超螺旋和环状等天然结构DNA电泳速率的2倍，并且不容易被嵌入染料染色。碱裂法在制备治理过程中常会产生不同数量折叠形式的DNA。上述这种方法适用于15kby以下的质粒，大于15kb的质粒在提取过程中很容易断裂，可用等渗蔗糖溶液裂解细菌，并用溶菌酶和EDTA（乙二胺四乙酸）去除细胞壁，可解决受损。产生的原生质球可通过加入去污剂（如SDS）被裂解。 试剂盒一般采用DNA选择性吸附稳定固相（通常是二氧化硅或者硅酸盐）的特性进行DNA纯化。在高PH、高盐缓冲液中，DNA会吸附到二氧化硅介质上面，在低盐浓度下可被洗脱下来。玻璃表面的阳性粒子随后可以在DNA骨架中磷酸负电基团和硅醇负电基团（Si-OH）之间形成盐桥，结合强度与成桥离子类型有关。一旦DNA与介质结合，他就会与其他的生物多聚物（如RNA和糖）分开。得率由DNA大小决定，片段越小，与二氧化硅结合越紧密，得率越低。 实验开始前，最主要的是细菌培养。试剂说明书建议使用DH5α，DH1，C600，都可以，XL1-Blue虽然长 的很慢但是也可以使用。其次培养基的使用建议采用LB培养基，其他的均不建议。 开始细菌培养前，最好涂板调菌培养，这样可以保持菌的活性，甘油保存的菌可能会产量低或者质粒丢失。 当挑取单菌落后放入37℃，300rpm，培养12~16h。 为了获得最佳质粒产率，起始培养体积应基于培养细菌密度。 建议使用OD600的和之间的细菌提取质粒。 使用富含营养素的介质时，应注意确保细菌密度不超过的OD600，最后菌液OD600为。 在推荐的OD范围之外使用高密度培养可能会超过纯化体系。 注意： 曝气是很重要的，LB培养基的体积应该是容器的1/4 随着培养时间的加长，由于细菌的死亡和裂解，DNA的产量开始下降。

质粒的抽提与纯化实质上是将质粒DNA与细菌的基因组染色体DNA、RNA、蛋白质、细胞膜等细 胞器及其他大分子物质分离的过程，因此质粒的抽提大致可分为：细菌的培养、收集与裂解；质粒DNA 的分离与纯化；浓度、纯度的鉴定三个过程。 ①染色体DNA的去除 ：在富集培养目标菌种后，首先应裂解细菌细胞，采用含有SDS的NaOH溶液裂解菌体释放质粒，同时氢氧化钠的强碱性，可使DNA氢键断裂，双螺旋结构破坏而变性，再加入中和缓冲液，可使部分变性的质粒DNA复性，而染色体DNA不复性，因此使质粒DNA与染色体 DNA分离开。 ②细菌中的RNA可以通过RNaseA去除 ③蛋白质的去除 ：细菌中的蛋白质可以通过酚/氯仿/异戊醇抽提，酚可以使蛋白质变性，氯仿将微溶 于水的酚抽提到有机相中，使其与水相中的DNA分离。分离后的质粒DNA可以通过乙醇回收，乙醇可以消除核酸水化层，暴露其带负电的磷酸基团，因 此在阳离子充足的环境中可以发生”核酸–乙醇沉淀 ④蛋白质、染色体DNA、细胞碎片、以及在分离过程中与试剂形成的不溶复合物都可以通过离心去除。 ⑤试剂盒法DNA的回收 :除碱裂解法以外，还可以通过试剂盒抽提质粒DNA，在碱裂解进行变性和复性后的纯化回收通过纯化柱进行。纯化柱中的硅胶膜能在高盐、低PH条件下吸附体系中的 DNA，将其与其他杂志分离，而在低盐、高PH条件下DNA又可以被洗脱下来。 ⑥纯化后的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计鉴定 电泳法 ：带负电荷的DNA分子在外加电场的作用下向正极泳动，不同分子量大小与构型的DNA分子泳动速率不同，因此可以在琼脂糖凝胶上呈现不同的条带。在凝胶中加入核酸染料可以方便我们观察，因为核酸染料可以嵌入到DNA碱基之间，避免被凝胶中的氢离子淬灭，因而亮度更高。 紫外分光光度法 ：DNA的吸收峰在260nm处，蛋白的吸收峰在280nm处，因此可以用OD260/OD280判断DNA纯度，一般认为比值在之间时，纯度较高 材料： 含有pSK II质粒的大肠杆菌菌株的菌液、含有MP3质粒的大肠杆菌菌株的菌液 试剂： ①细菌的培养：LB培养基、氨苄青霉素 ②细菌的裂解与收集：溶液I（Tris-HCl、EDTA、Glucose）、溶液II（NaOH、SDS）、溶液 III（KOAc、CH3COOH）、RNAseA③质粒DNA的分离与纯化：酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇、70%乙醇、1XTE溶液（Tris-HCl、 EDTA）、东盛生物小提质粒盒④电泳：琼脂糖、电泳缓冲液、StarGreen DNA Dye、loading buffer、1XTE buffer①细菌的培养： 将含有pSK II和MP3质粒的大肠杆菌菌液分别于LB培养基上划线 → 37℃过夜培养 → 挑取培养基上的单菌落于液体LB培养基中，震荡培养过夜②细菌的收集与裂解 - 碱裂解法 吸取菌液12000rpm离心1min (沉淀菌体)↓弃上清培养液 (完成细菌的收集)↓加入150ul溶液I和3ul RNaseA，震荡混匀，静置2min (悬浮菌体、去除RNA)↓加入250ul溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮(不超过5min。裂解菌体、释放质粒，此步骤动作轻柔，防止基因组DNA断裂，且时间不宜过长)↓加入180ul溶液III，颠倒混匀，冰浴10min （中和反应，防止基因组DNA污染）↓12000rpm离心5min，吸取上清80ul，重复此操作 (此时已完成了染色体DNA、RNA、细胞碎片、部分 蛋白质的分离)③质粒DNA的分离 加入53ul的酚/氯仿/异戊醇上下颠倒抽提10min，静置分层 （DNA在水相中），12000rpm 离心10min↓通风橱中吸取上清，加入20体积的无水乙醇 （发生核酸-乙醇沉淀）↓12000rpm离心5min,倒掉乙醇，短暂离心10s，用移液枪吸取乙醇↓加入500ul 70％乙醇洗涤DNA沉淀，离心5min，倒掉乙醇，离心10s，用移液枪吸取乙醇，将其放置在通风橱中促进乙醇挥发↓加入300ul 1XTE溶解，65℃热板温育10min④纯化质粒DNA 加入1XTE使溶液为300ul，加入300ul酚/氯仿，充分震荡抽提5min(去除蛋白)↓12000rpm离心5min，吸取上清↓加入1/10体积3M NaAc和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀↓置于-70℃冰箱15min沉淀DNA↓4℃12000rpm离心15min，倒掉乙醇，离心10s，用移液枪吸去乙醇↓ 70%乙醇洗DNA沉淀一次，离心2min，倒掉乙醇 （去除DNA中的盐离子）↓离心10s，移液枪吸去乙醇，在50-60℃热板上烘干1min↓加入20ul 1XTE溶解DNA沉淀，并在65℃热板上温育10min （使DNase失活） -试剂盒抽提法 加入溶液III离心后的上清液置于DNA纯化柱中，静置2min↓12000rpm离心1min，弃滤液 （DNA被吸附到硅胶膜上）↓加入500ul溶液PB，12000rpm离心1min，弃滤液 （洗脱蛋白、盐等杂质）↓加入500ul溶液W，12000rpm离心1min，弃滤液 （重复此步骤一次，洗掉多余盐离子及乙醇）↓12000rpm离心3min （彻底去除纯化柱中残留的液体）↓将DNA纯化柱置于新的离心管中，向纯化柱中央处悬空滴加80ul溶液Eluent，室温静置2min （将硅胶吸附柱上的质粒DNA洗脱下来）↓12000rpm离心1min （管底即为质粒DNA）⑤琼脂糖凝胶电泳观察 制胶： 称取琼脂糖加入盛100ml 电泳缓冲液的250ml 三角瓶中，摇匀↓微波炉加热至琼脂糖溶解（沸腾）↓放在冷水中冷却，加入10ul的StarGreen DNA Dye，摇匀↓琼脂糖倒入模具中，插上梳子 。凝固后向上垂直拔出梳子，将凝胶转移到电泳槽中，加入电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1mm点样： 按照碱裂解法纯化前的MP3、pSK II样品各3ul、5ul Marker（10ug/ul、20ug/ul、60ug/ul）、碱裂解法纯化后的MP3、pSK II样品各6ul，试剂盒提取的MP3、pSK II样品各2ul的顺序依次加入点样板小孔中，再分别加入10Xloading buffer，配置10ul点样体系，吹吸混匀电泳： 打开电源开关，调节电压3-5V/cm观察： 将电泳好的凝胶置于凝胶成像仪中观察

质粒抽提方法即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。实验原理提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。详细内容请参考《分子克隆实验指南》。[1] 另外，复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章，提供了质粒提取机理的详细解说。碱裂解法人们使用碱与SDS裂解法从E. coli（大肠杆菌）中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL以上。煮沸法煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是。闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取少至lmL（小量制备），多至250mL（大量制备）菌液的质粒，并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。但对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株，则不推荐使用该法。这是因为碳水化合物很难除去，会抑制限制酶和聚合酶活性。若碳水化合物的量很大，在CsCl-溴化乙锭梯度离心中会使超螺旋质粒DNA带变得模糊不清。大肠杆菌菌株HBl01及其衍生菌株（其中包括TGl）能产生大量的碳水化合物，不适于用煮沸法裂解。质粒小提试剂盒用于大肠杆菌中质粒DNA的小量提取，它结合了优化的碱裂解法，以及方便快捷的硅膜离心技术，具有高效，快捷的特点，能在30min内完成全部操作。利用试剂盒能从1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液中纯化得到10-40μg高质量的质粒DNA（OD260/OD280=），此质粒DNA可直接用于DNA序列分析，各种酶促反应，PCR以及部分细胞系的转染等。