蛋白质纯化毕业论文

蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。被食入的蛋白质在体内经过消化分解成氨基酸，吸收后在体内主要用于重新按一定比例组合成人体蛋白质，同时新的蛋白质又在不断代谢与分解，时刻处于动态平衡中。因此，食物蛋白质的质和量、各种氨基酸的比例，关系到人体蛋白质合成的量，尤其是青少年的生长发育、孕产妇的优生优育、老年人的健康长寿，都与膳食中蛋白质的量有着密切的关系[编辑本段]蛋白质的生理功能1、构造人的身体：蛋白质是一切生命的物质基础，是肌体细胞的重要组成部分，是人体组织更新和修补的主要原料。人体的每个组织：毛发、皮肤、肌肉、骨骼、内脏、大脑、血液、神经、内分泌等都是由蛋白质组成，所以说饮食造就人本身。蛋白质对人的生长发育非常重要。比如大脑发育的特点是一次性完成细胞增殖，人的大脑细胞的增长有二个高峰期。第一个是胎儿三个月的时候；第二个是出生后到一岁，特别是0---6个月的婴儿是大脑细胞猛烈增长的时期。到一岁大脑细胞增殖基本完成，其数量已达成人的9/10。所以0到1岁儿童对蛋白质的摄入要求很有特色，对儿童的智力发展尤关重要。2、修补人体组织：人的身体由百兆亿个细胞组成，细胞可以说是生命的最小单位，它们处于永不停息的衰老、死亡、新生的新陈代谢过程中。例如年轻人的表皮28天更新一次，而胃黏膜两三天就要全部更新。所以一个人如果蛋白质的摄入、吸收、利用都很好，那么皮肤就是光泽而又有弹性的。反之，人则经常处于亚健康状态。组织受损后，包括外伤，不能得到及时和高质量的修补，便会加速机体衰退。3、维持肌体正常的新陈代谢和各类物质在体内的输送。载体蛋白对维持人体的正常生命活动是至关重要的。可以在体内运载各种物质。比如血红蛋白—输送氧（红血球更新速率250万/秒）、脂蛋白—输送脂肪、细胞膜上的受体还有转运蛋白等。4、白蛋白：维持机体内的渗透压的平衡及体液平衡。5、维持体液的酸碱平衡。6、免疫细胞和免疫蛋白：有白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、抗体（免疫球蛋白）、补体、干扰素等。七天更新一次。当蛋白质充足时，这个部队就很强，在需要时，数小时内可以增加100倍。7、构成人体必需的催化和调节功能的各种酶。我们身体有数千种酶，每一种只能参与一种生化反应。人体细胞里每分钟要进行一百多次生化反应。酶有促进食物的消化、吸收、利用的作用。相应的酶充足，反应就会顺利、快捷的进行，我们就会精力充沛，不易生病。否则，反应就变慢或者被阻断。8、激素的主要原料。具有调节体内各器官的生理活性。胰岛素是由51个氨基酸分子合成。生长素是由191个氨基酸分子合成。7、构成神经递质乙酰胆碱、五羟色氨等。维持神经系统的正常功能：味觉、视觉和记忆。8、胶原蛋白：占身体蛋白质的1/3，生成结缔组织，构成身体骨架。如骨骼、血管、韧带等，决定了皮肤的弹性，保护大脑（在大脑脑细胞中，很大一部分是胶原细胞，并且形成血脑屏障保护大脑）9、提供热能。[编辑本段]蛋白质的作用蛋白质在细胞和生物体的生命活动过程中，起着十分重要的作用。生物的结构和性状都与蛋白质有关。蛋白质还参与基因表达的调节，以及细胞中氧化还原、电子传递、神经传递乃至学习和记忆等多种生命活动过程。在细胞和生物体内各种生物化学反应中起催化作用的酶主要也是蛋白质。许多重要的激素，如胰岛素和胸腺激素等也都是蛋白质。此外，多种蛋白质，如植物种子（豆、花生、小麦等）中的蛋白质和动物蛋白、奶酪等都是供生物营养生长之用的蛋白质。有些蛋白质如蛇毒、蜂毒等是动物攻防的武器。蛋白质和健康蛋白质是荷兰科学家格里特在1838年发现的。他观察到有生命的东西离开了蛋白质就不能生存。蛋白质是生物体内一种极重要的高分子有机物，占人体干重的54%。蛋白质主要由氨基酸组成，因氨基酸的组合排列不同而组成各种类型的蛋白质。人体中估计有10万种以上的蛋白质。生命是物质运动的高级形式，这种运动方式是通过蛋白质来实现的，所以蛋白质有极其重要的生物学意义。人体的生长、发育、运动、遗传、繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。生命运动需要蛋白质，也离不开蛋白质。球状蛋白质(三级结构)人体内的一些生理活性物质如胺类、神经递质、多肽类激素、抗体、酶、核蛋白以及细胞膜上、血液中起“载体”作用的蛋白都离不开蛋白质，它对调节生理功能，维持新陈代谢起着极其重要的作用。人体运动系统中肌肉的成分以及肌肉在收缩、作功、完成动作过程中的代谢无不与蛋白质有关，离开了蛋白质，体育锻炼就无从谈起。在生物学中，蛋白质被解释为是由氨基酸借肽键联接起来形成的多肽，然后由多肽连接起来形成的物质。通俗易懂些说，它就是构成人体组织器官的支架和主要物质，在人体生命活动中，起着重要作用，可以说没有蛋白质就没有生命活动的存在。每天的饮食中蛋白质主要存在于瘦肉、蛋类、豆类及鱼类中。蛋白质缺乏：成年人：肌肉消瘦、肌体免疫力下降、贫血，严重者将产生水肿。未成年人：生长发育停滞、贫血、智力发育差，视觉差。蛋白质过量：蛋白质在体内不能贮存，多了肌体无法吸收，过量摄入蛋白质，将会因代谢障碍产生蛋白质中毒甚至于死亡。[编辑本段]必需氨基酸和非必需氨基酸纤维状蛋白质(二级结构)食物中的蛋白质必须经过肠胃道消化，分解成氨基酸才能被人体吸收利用，人体对蛋白质的需要实际就是对氨基酸的需要。吸收后的氨基酸只有在数量和种类上都能满足人体需要身体才能利用它们合成自身的蛋白质。营养学上将氨基酸分为必需氨基酸和非必需氨基酸两类。必需氨基酸指的是人体自身不能合成或合成速度不能满足人体需要，必须从食物中摄取的氨基酸。对成人来说，这类氨基酸有8种，包括赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸。对婴儿来说，组氨酸和精氨酸也是必需氨基酸。非必需氨基酸并不是说人体不需要这些氨基酸，而是说人体可以自身合成或由其它氨基酸转化而得到，不一定非从食物直接摄取不可。这类氨基酸包括谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸等。有些非必需氨基酸如胱氨酸和酪氨酸如果供给充裕还可以节省必需氨基酸中蛋氨酸和苯丙氨酸的需要量。

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Self-introduction:I am Kong Yuhua, born in Jan 20th, 1984 in JiLin province. I graduated from Dalian Nationalities University with bachelor's degree in July of 2007, and my major is biological engineering. I was born in a harmonious but strict family. My parents teached me to have a sense of responsibility to anything ,which also developed my strict character and desire for the knowledge. I am introverted, enterprising,honest and have stong teamwork spirt, so I can adapt to different condition. I was interested in natural science when I was little, during my study , my biology teacher also influence me , so I choose biological engineering in the college. During the four-years study in the college , I got all-around college basic educatio, I study all the courses hard in biological area with exact goal, I grasped theoretical basis and necessary skill all sidedly. At same time , I put the theory knowledge into practice , when I work as a research assistant, I learnt this experimental concept : Scientific Rigour, this also built up my Practical Ability. After I graduated, I was engaged in Protein Purification in Takara Bio, turned my knowledge into practiceal ability and productive ability .It made me have a deeper understanding to theory and practice of professional knowledge. In work process, I feel the rapid develpment of technology and constantly changing knowledge structure ,which made me have a strong idea for further study. Through further study , master the theory and experiment of bioscience. For this reason, I got an idea to go abroad for graduate study. Korea is the economic power in Asia ,and is the developed country with stable public and friendly people. Secondly, the technology power in your country rank among the world ,is the most ideal campus for further study. Therefore , I want to go to Korea for further study. I sincerely hope that I can go to Korea for study , if it can come true,I think it can expand my horizon ,increase my knowledge and learn advanced professional knowlege ,which can establish a good basis for my future study and work. My major is bioscience ,which include: biochemistry, molecular biology, cytobiology,microbiology, development biology ,genetics and so on. In the period of college , with the carecful guidance of mhy teacher, I learnt the operation of different basic experiments, and learnt cell culture and inspection when I did thesis 5-Fu and the research on CF induce cancer cell apoptosis, I learnt various methods of Protein Purification and related skill of analysis of content and purity. If I can have this opportunity to study in your school, I must grasp this valuable opportunity to require myself strictly to improve professional knowledge,make use of all the time to learn advanced concept . I hope I can have a deeper research in bioscience with the guidance of experts in your school. In order to study and research better, I wil try my best to improve my English ,read extensively all kinds of newest scientific achievements. My goal is to widen my knowledge, enhance Innovative thinking ability, become a professional researcher with both theory and experiment ability. Also put my professional knowledge into practice . Go abroad in Korea , I will put into my total enthusiasm, during this period ,I will try my best to enrich myself , face the future study and life actively. I am so pleased to meet this challenge, I regard it as one of the most steps in my life experiences. For this step, I will get ready for everything, try to make my dream come true.

……………………………………（十） 永远的转录因子第一个模块的实验结束以后，我们进入第二个模块的实验。这个实验的指导教授叫Al Courey。这个模块的实验主要是要从Hela细胞里纯化AP-1。AP1是一种很重要的sequence specific转录因子，在很多生理过程里都有作用。AP-1其实不是一种均一的蛋白质，实际上一种二聚体结构，要么是Jun-Jun 或者是JunFos dimer。Jun和Fos都是alpha helix的结构。Helix的一边有很多Leu,和另一个helix形成Leucine Zipper的结构，而helix另一边就是碱性的氨基酸居多，所以可以和DNA 结合。这个转录因子看起来就象一双筷子夹着DNA。sequence specific转录因子是极其重要的一类蛋白质，真核生物的基因有5~10%是用来编码这种蛋白的。这个模块涉及的一些实验是最经典的一些分离转录因子的方法，所以很有用。怎么才能分离纯化呢？首先要确定要纯化什么因子，换句话说就是要决定纯化跟什么特异DNA序列相结合的转录因子。决定了这个，才能有一个活性检测系统，才能真正开始纯化。另外就是，可以把这种特异序列的DNA固定在柱子上，然后做亲合层析，纯化效率会非常高。整个纯化过程是这样的：首先制备Hela细胞的核提取物，然后用硫酸氨沉淀的办法粗分一下组分，小分子量蛋白(比如Histone H1) 因为无法沉淀而被去掉。到这里比活力会增加到原来的2倍。然后粗分的产物再跑一下凝胶过滤层析，比活力再提高到初始产物的5到10倍。凝胶过滤的产物再过DNA affinity column, 比活力从5-10倍一下子提到了50~100倍。到了这一步，AP-1可以占到蛋白量的 10~50%。值得一提的是这个凝胶过滤层析。我们用的是Sephacryl S-300 HR 凝胶(一种聚丙烯酰胺凝胶)，这种凝胶分辨范围大概是10KDa到几千KDa，但是这种凝胶是比较粗的一种介质，分辨率不能跟superdex之类的比。大概由于不是那么精细，所以可以自己手工装柱，我们用的柱子是Amersham的XK26/40(直径, 高度40cm）。装好的柱子分辨率真的是很低，AP1的洗脱体积跟空体积(void volume）相差挺小，而AP-1只有40~50KD已经很小了。这样一来很多蛋白根本没可能和AP-1分开！这也就是为什么这一步纯化倍数很小的原因。这样一来，为什么要自找麻烦做这又贵又麻烦的一步呢？原因在于这一步可以去掉核提取物里面的核酸酶，所以如果直接跑DNA affinity column, column上的DNA Oligos会被降解掉！另外一个原因是，核提取物有一些可以和DNA非特异结合的蛋白，这些蛋白会饱和DNA affinity column，影响要转录因子的纯化。这个纯化步骤说明，不同的纯化手段必须加以精心组合才会有最好的效果。（十一）核抽提物上回谈到纯化AP-1转录因子的大致流程。其实在过柱子之前的核抽提物的准备也是十分关键的。从天然产物中纯化蛋白，如果大概知道蛋白在什么细胞器官，把细胞器先分离出来作为纯化的起始原料，可以省好多事情。因为细胞器官的分离的方法已经很成熟了。核抽提物是怎么准备的呢？首先，融解Hela细胞。我们在这个模块用的细胞都不是自己长的，而是直接从一个公司Biovest 买来的。据说这个公司有NIH的补贴，所以价钱不贵。一升media的Hela细胞才要17刀。冻存在-80度的hela泡在有glycerol的buffer里面，第一件事情就是要用有镁离子的PBS来冲洗几遍。然后用一种低渗buffer来重悬细胞。这种低渗buffer盐浓度很低，所以由于渗透压的影响，hela细胞膜会变得比较脆弱。这个时候呢，把重悬的细胞用Dounce 匀浆器处理一下,把细胞膜弄破。低渗buffer里头虽然盐浓度很低，但也不是没有盐在里面。主要有两种成分，一个是10mM KCl ,另一个是 MgCl2。KCl没有什么好说的，可以换成NaCl。MgCl2 就关键多了。镁离子可以稳定细胞核, 让细胞核不至于在破碎细胞的时候就破裂。当然说是这么说，一些转录因子还是可能在匀浆的过程就漏出来。细胞膜破碎之后，细胞核还是基本完整的，细胞质里面ER , Golgi之类的东东都漏出来了。然后再来一个低速离心。细胞核是比较重的，所以一离心，马上就沉淀下来了。而其他细胞质或者细胞膜的成分比较轻一些，还留在上清里面。现在想起来，细胞器官的分离，几乎无一例外都是利用细胞器比重不一样来分离的。细胞核是最好分离的了，因为比其他的膜结构重得多。有些细胞器，比如要把Golgi和ER分开，是个十分麻烦的事情，因为比重相差太小了。有些时候，可以用一些古怪的办法来分离。比如lysosome把，比重和线粒体及过氧化酶体很相近。一种办法就是往一堆无辜的耗子注射一种特殊的去垢剂叫Triton WR1339。耗子根本不能分解吸收这种化合物，就积累在肝脏细胞的lysosome里面，使得lysosome比重变轻了一些，这样就可以把lysosome从mitonchondria和peroxysome分出来了。话扯远了，现在再回到AP-1purification。细胞核虽然被沉淀下来了，但里面还有很多染色质,如果DNA都降解漏出来，麻烦就大了。所以下一步就是用高盐buffer( KCl)来破碎细胞核。核膜，染色质之类的垃圾不能溶解，转录因子之类的蛋白却能溶解。再一离心，取上清就行了。我们要的转炉因子就在这里面。按理说，到这一步就可以上柱子了，但是这种上清溶液里面还有不少histone H1，可以抑制体外转录反应。为了祛除hisone, 我们又做了一步硫酸氨沉淀，histone由于太小，沉淀不下来，而转录因子什么的都可以被沉淀下来。沉淀重悬一下就可以跑Sephacryl S-300 的柱子了。