本研究构建了MsGCHI和MsADCS基因的双价植物表达载体，并将其导入优良豆科牧草百脉根中，成功创制了高叶酸含量和高产的转基因百脉根株系，可为进一步培育高叶酸含量豆科牧草新品种奠定基础，有望从根本上解决饲料中叶酸普遍匮乏的问题开辟新途径，同时大幅降低养殖成本。
第一章 国内外研究进展
1.1 叶酸的生物学功能
叶酸是动植物生长发育所必需的微量营养素，因其在生物甲基化和表观遗传机制中的重要作用而备受关注。叶酸的生物学功能主要有：（1）作为C1单位的载体，参与蛋白质、磷脂代谢；（2）作为辅酶参与嘌呤、嘧啶的合成，直接影响DNA的修复、合成及甲基化；（3）参与关键氨基酸的合成，并催化氨基酸之间的相互代谢转化；（4）作为潜在的抗氧化剂，能够清除自由基及其代谢产物，维持正常的细胞生理活动；（5）作为维持植物细胞正常功能的基础物质，参与植物细胞内多个生理过程（Jiang等，2013；Gursu等，2004；Abbasi等，2018）。
1.1.1 叶酸对人体健康的作用
1.1.1.1 叶酸与神经管缺陷
神经管缺陷（Neural tube defects, NTDs）是妊娠初期胚胎发育过程中由于神经管闭合失败所致的先天性畸形，是造成死胎、死产、婴儿死亡和残疾的一个主要原因，严重影响新生儿健康和人口素质（Blom等，2006）。据估计，全球每年约有260100名新生儿罹患NTDs；在我国，每1250名新生儿中就有1名受到NTDs的影响（Blencowe等，2018；裴娇娇等，2021）。
NTDs主要由遗传和环境因素引起，而叶酸缺乏是众多环境影响因素之一（Peake等，2013）。研究表明，补充叶酸是预防NTDs最强有力的策略，围孕期妇女服用叶酸增补剂会使其婴儿患NTDs的风险降低50-75%（Balashova等，2017），当孕妇每天的叶酸摄入量从150 ng/ml上升到400 ng/ml时，婴儿患NTDs的风险也从6.6‰下降到0.8‰（James等，2000）。如果在围孕期服用作为叶酸拮抗剂的药物（如马西平、甲氧苄啶），可能会使受NTDs影响的怀孕风险增加一倍，但通过叶酸的额外补充可有效降低由叶酸拮抗剂带来的NTDs风险，因此在受孕期增加叶酸摄入量将会降低NTDs的发生率和复发率（Hernández等，2000）。在妊娠期，通过补充FA和强化谷类面粉的叶酸以减少NTDs的发生和复发，被认为是过去几十年来预防出生缺陷的有效策略，这在NTDs发生率最高的地区最为显著（Dean等，2020）。
第二章 MsGCHI和MsADCS基因双价表达载体的构建及对百脉根的遗传转化
2.1 材料和方法
2.1.1载体、植物材料、农杆菌和质粒
本实验所用pBIB-BASTA-GWR-YFP和pCAMBIA1302-Bar为本实验室保存（张婧，2019），pCAMBIA1300-pGmUbi由中国农业大学张万军博士赠送。所采用的百脉根品种为Leo（种子由中国农业科学院作物科学研究所周美亮研究员惠赠）；所用农杆菌EHA105，为本实验室保存。
2.1.2 实验试剂
第三章 温室和大田条件下转基因百脉根叶酸及其组分含量的分析和生长性状评价
3.1 材料与方法
3.1.1 温室条件下植物材料培养
将筛选出的5个超表达转基因百脉根株系分别命名为GA-2、GA-3、GA-5、GA-10和GA-11，移栽至装有无菌蛭石的花盆中，用1/2 Hoagland营养液浇灌培养。并利用扦插法对转基因株系和野生型百脉根植株进行无性扩繁，每隔2天浇水一次，待扦插苗生根后移栽至装有无菌蛭石的花盆中，用1/2 Hoagland营养液浇灌培养，植物培养室中温度为24±2°C、光照为16 h·d-1、相对湿度为65%左右。
3.1.2 大田条件下植物材料培养
将叶酸含量最高、生长较好的GA-3株系重新编号为GA-1，向农业农村部转基因生物安全管理办公室申请获批转“MsGCHI和MsA DCS基因高叶酸百脉根GA-1在甘肃省的中间试验”。
本研究以野生型（WT）、共转化MsGCHI和Ms ADCS的百脉根（GA-1）为材料，利用扦插法对转基因GA-1和野生型百脉根植株进行无性扩繁，培养方法同“3.1.1”。
3.1.3 大田试验设计
3.2 结果分析
3.2.1温室条件下转基因百脉根株系中叶酸及前体含量分析
采用高效液相色谱-串联质谱技术（HPLC-MS/MS）对野生型和选定的5个转基因株系（8周龄）的叶酸及前体含量进行分析。结果表明，共表达MsG CHI和MsADCS基因对百脉根株系体内叶酸和前体含量产生了显著影响，转基因株系中叶酸和蝶呤含量均显著高于野生型，除转基因株系GA-10以外，其余转基因株系中p-ABA含量均显著高于野生型（图3-2）。野生型植株叶中叶酸含量为1.08 µg/100g FW，蝶呤含量为0.31 µg/100g FW，p-ABA含量为0.03 µg/100g FW。在5株转基因百脉根株系中，叶中叶酸、蝶呤和p-ABA含量与野生型相比平均提高了2.5倍、2.7倍和0.6倍；茎中叶酸、蝶呤和p-ABA含量与野生型相比平均提高了2.0倍、3.3倍和2.1倍；其中GA-3株系叶和茎中叶酸含量分别达到4.68 µg/100g FW和2.99 µg/100g FW，与野生型植株相比提高幅度最大，分别提高了3.3倍和2.9倍；与野生型植株相比，GA-5株系叶中蝶呤和p-ABA含量提高幅度最大，分别提高了3.7倍和1.6倍，GA-3株系茎中蝶呤含量提高幅度最大，提高了6.1倍，GA-10株系中p-ABA含量提高幅度最大，提高了3.7倍。
进一步分析野生型和转基因百脉根茎和叶中叶酸、蝶呤和p-ABA含量发现（图3-3），无论是野生型植株还是转基因株系，其叶中叶酸含量显著高于茎，除GA-5株系外，各株系茎中蝶呤和p-ABA含量显著高于叶。
论文的特色与创新点
叶酸缺乏是一个全球性的健康问题，通过服用或在饲料中添加人工合成叶酸是目前补充人类和动物对叶酸需求的主要途径，但该途径成本较高，且存在一定的副作用。通过转入叶酸合成关键酶基因提高叶酸含量已在很多植物上得以实现，但大多高叶酸含量的转基因植物还停留在实验室阶段，没有进入生产应用，并且在牧草中进行叶酸的生物强化方面的研究还未见报道，更未见将转基因植物作为生物反应器生产叶酸。
1. 本研究构建了MsGCHI和MsADCS基因的双价植物表达载体，并将其导入优良豆科牧草百脉根中，成功创制了高叶酸含量和高产的转基因百脉根株系，可为进一步培育高叶酸含量豆科牧草新品种奠定基础，有望从根本上解决饲料中叶酸普遍匮乏的问题开辟新途径，同时大幅降低养殖成本。
2. 转基因植物的田间评价是进一步确认实验室数据和在相对开放环境下评价转入基因效果的必要步骤，也是转基因作物推广生产前进行安全性评价的首要环节。本研究向农业农村部转基因生物安全管理办公室申请获得“转MsG CHI和MsADCS基因高叶酸百脉根GA-1在甘肃省的中间试验”的批复，通过控制性田间试验，进一步评价了转基因株系的生长性状、茎和叶中的叶酸及其组分含量，有望将转基因百脉根作为生物反应器大量生产天然叶酸，以满足人类的日常所需，缓解当今叶酸摄入不足的难题。
参考文献（略）
（本文摘自网络）
