有关酵母耐受性的文献综述论文

以糖类、淀粉和其它工农业副产物为原料，用发酵培养法生产的微生物制品。是酵母菌的简称。酵母是人类直接食用量最大的一种微生物。 1986年，全世界面包酵母的年产量为180万吨 (以30％固形物计)。酵母菌体含有丰富的蛋白质、脂肪、糖分和B族维生素等,以及酶、辅酶、核糖核酸、甾醇和一些新陈代谢的中间产物。有些酵母菌如酿酒酵母在嫌气条件下具有将糖转化为乙醇和二氧化碳的能力。 发展简史 公元前2300年，人类就开始利用含酵母的“老酵”制作面包。从埃及塞倍斯(Thebes)地区出土的面包房和酿酒房的残余模型看，早在公元前2000 年人类就已较好地利用酵母制作发酵食品和酿酒。公元前13世纪，面包焙烤的技术从埃及传到地中海和其它地区。1680年 A.van列文虎克用显微镜从一滴啤酒中发现酵母细胞，不久，人类就开始有意识地利用酵母（啤酒酵母泥）发面。酵母的重要性逐渐引起工业界的注意。 19世纪中期，欧洲工业革命产生了大量人口密集地区，要求工业界大规模的生产面包酵母以满足生产面包的需要。1846年，奥地利人 M.马克霍夫在维也纳建立世界上第一个酵母厂。该厂以粮食为原料,采用温和的通风培养法同时得到酵母和酒精，此法被称为“维也纳法”。因为是采用压榨机将 酵母从培养液中分离出来，所以产品称为“压榨酵母”。1876年，法国人L.巴斯德关于空气中的氧能促进酵母繁殖理论的发表，为大规模通风培养生产酵母奠定了基础。20世纪初期，由于酵母离心机的问世，丹麦和德国开始采用楚劳夫(Zulauf)法生产酵母，即将糖液缓慢地流入通风的发酵液内，俗称“流加培 养法”、“批式培养法”。楚劳夫法产品得率高，原料消耗低，过程易于控制，一直沿用至今，并不断得到改进和完善。20世纪20年代起，酵母生产用原料扩大 到使用糖蜜、木材水解液、亚硫酸纸浆废液和糖蜜酒精糟液等。60年代，以石油、煤炭和天然气等碳氢化合物及其二次加工产品（如醋酸、乙醇和甲醇等）为原料的工厂相继建立，改变了长期以来人们利用碳水化合物为原料的传统。 第一次世界大战爆发不久，德国开始研究用现代化方法生产酵母，以解决粮食缺乏和生产成本高的问题。至此，生产的实践和科学的发展为活性干酵母的生产提供了条件。第二次世界大战的爆发客观上推动了酵母生产的发展。由于压榨酵母含水量高，易于腐败，需要冷藏车运输等因素，不能满足战时特 殊环境的要求，导致活性干酵母的大规模生产。1945年，美国和欧洲一些军事机构、工厂共生产 400多万磅活性干酵母供战时急需。活性干酵母除主要供应面包和糕点等焙烤行业外，已扩大到在酿酒主要是葡萄酒和其它果酒酿造中应用。由于遗传工程和干燥技术的发展，一种新型的、高发酵力的、可直接与面粉混合使用制成面团的快速活性干酵母在60年代末问世，由荷兰古斯特公司首先开发和生产。 中国的酵母生产始于1922年。1949年以前只有上海大华利卫生食料厂和上海新亚酵素厂生产面包酵母，年产量仅为12t（以干酵 母计）。50年代,中国的酵母生产有了较大的发展，建立了数十家生产厂，并形成了独立的工业体系，80年代初，酵母生产厂已迅速增加到40多家。广东省酵 母生产居全国首位,到1988年,已建成年产2kt快速活性干酵母工厂两家。此外,江苏、河南等地建成利用味精废液、酒精废液等生产饲料酵母的工厂，年产量为 100～500t。面包酵母的种类已由单一的压榨酵母增加了活性干酵母、快速活性干酵母。食用酵母、药用醇母和饲料酵母的生产也有不同程度的发展。 1985年，中国酵母总产量已达11kt，其中面包酵母为5kt左右。 世界酵母生产正向大型化和自动化方向发展，生产过程已由计算机控制，劳动生产率高，如丹麦酒精公司酵母厂平均每人每年生产200t 压榨酵母。面包酵母产量较大的有荷兰吉斯特公司，年产量为200kt,其中一半加工成快速活性干酵母出口；法国勒沙夫公司为150kt;美国环球食品公司 为120kt。 产品种类 酵母产品有几种分类方法。以人类食用和作动物饲料的不同目的可分成食用酵母和饲料酵母。食用酵母中又分成面包酵母、食品酵母和药用酵母等。 面包酵母 又分压榨酵母、活性干酵母和快速活性干酵母。 ①压榨酵母：采用酿酒酵母生产的含水分70～73％的块状产品。呈淡黄色,具有紧密的结构且易粉碎,有强的发面能力。在4℃可保藏1个 月左右，在0℃能保藏2～3个月。产品最初是用板框压滤机将离心后的酵母乳压榨脱水得到的，因而被称为压榨酵母，俗称鲜酵母。发面时，其用量为面粉量的 1～2％,发面温度为28～30℃,发面时间随酵母用量、发面温度和面团含糖量等因素而异，一般为1～3小时。 ②活性干酵母:采用酿酒酵母生产的含水分8％左右、颗粒状、具有发面能力的干酵母产品。采用具有耐干燥能力、发酵力稳定的醇母经培养得到鲜酵母，再经挤压成型和干燥而制成。发酵效果与压榨酵母相近。产品用真空或充惰性气体（如氮气或二氧化碳）的铝箔袋或金属罐包装，货架寿命为半年到 1年。与压榨酵母相比,它具有保藏期长，不需低温保藏，运输和使用方便等优点。 ③快速活性干酵母：一种新型的具有快速高效发酵力的细小颗粒状（直径小于1mm）产品。水分含量为4～6％。它是在活性干酵母的基 础上,采用遗传工程技术获得高度耐干燥的酿酒酵母菌株，经特殊的营养配比和严格的增殖培养条件以及采用流化床干燥设备干燥而得。与活性干酵母相同,采用真 空或充惰气体保藏,货架寿命为1年以上。与活性干酵母相比,颗粒较小,发酵力高,使用时不需先水化而可直接与面粉混合加水制成面团发酵，在短时间内发酵完毕即可焙烤成食品。该产品在本世纪70年代才在市场上出现，深受消费者的欢迎。 食品酵母 不具有发酵力的繁殖能力，供人类食用的干酵母粉或颗粒状产品。它可通过回收啤酒厂的酵母泥、或为了人类营养的要求专门培养并干燥而得。美国、日本及欧洲一些国家在普通的粮食制品如面包、蛋糕、饼干和烤饼中掺入 5％左右的食用酵母粉以提高食品的营养价值。酵母自溶物可作为肉类、果酱、汤类、奶酪、面包类食品、蔬菜及调味料的添加剂；在婴儿食品、健康食品中作为食品营养强化剂。由酵母自溶浸出物制得的5′-核苷酸与味精配合可作为强化食品风味的添加剂（见核苷酸类调味料）。从酵母中提取的浓缩转化酶用作方蛋夹心巧克力的液化剂。从以乳清为原料生产的酵母中提取的乳糖酶，可用于牛奶加工以增加甜度，防止乳清浓缩液中乳糖的结晶，适应不耐乳糖症的消费者的需要。 药用酵母 制造方法和性质与食品酵母相同。由于它含有丰富的蛋白质、维生素和酶等生理活性物质，医药上将其制成酵母片如食母生片，用于治疗因不合理的饮食引起的消化不良症。体质衰弱的人服用后能起到一定程度的调整新陈代谢机能的作用。在酵母培养过程中，如添加一些特殊的元素制成含硒、铬等微量元素的酵母，对一些疾 病具有一定的疗效。如含硒酵母用于治疗克山病和大骨节病，并有一定防止细胞衰老的作用；含铬酵母可用于治疗糖尿病等。 饲料酵母 通常用假丝酵母或脆壁克鲁维酵母经培养、干燥制成。是不具有发酵力,细胞呈死亡状态的粉末状或颗粒状产品。它含有丰富的蛋白质(30～40％左右)、B 族维生素、氨基酸等物质,广泛用作动物饲料的蛋白质补充物。它能促进动物的生长发育，缩短饲养期，增加肉量和蛋量，改良肉质和提高瘦肉率，改善皮毛的光泽度，并能增强幼禽畜的抗病能力。 产品质量 面包酵母的主要质量指针是发酵力，即在一定时间、温度和一定种类的面团中发酵排出的二氧化碳量（以ml数表示）。目前世界上通用的测定方法为黑达克面团 法。美国、西欧国家和中国等采用此法。苏联采用面团发酵后增加的体积量计算酵母的发酵力。罗马尼亚采用将面团沉入水中，计算面团浮到水面所需的时间计算酵母的发酵力。由于各酵母厂采用的测定条件如温度、时间、酵母用量、面团种类不同，尚没有统一的国际标准。一般发酵力的范围为500～1200,数值越大表 明酵母的发酵力越高，产品质量越好。食品酵母和药用酵母主要以蛋白质和 B族维生素含量为标准。饲料酵母主要以蛋白质含量为分级标准。 生理酵母营专性或兼性好氧生活，目前未知专性厌氧的酵母。在缺乏氧气时，发酵型的酵母通过将糖类转化成为二氧化碳和乙醇来获取能量。 C6H12O6 （葡萄糖） →2C2H5OH + 2CO2 在酿酒过程中，乙醇被保留下来；在烤面包或蒸馒头的过程中，二氧化碳将面团发起，而酒精则挥发。 生殖酵母可以通过出芽进行无性生殖，也可以通过形成子囊孢子进行有性生殖。无性生殖即在环境条件适合时，从母细胞上长出一个芽，逐渐长到成熟大小后与母体分离。在营养状况不好时，一些可进行有性生殖的酵母会形成孢子，在条件适合时再萌发。一些酵母，如假丝酵母（或称念珠菌，Candida）不能进行无性繁殖。 生产方法利用发酵工业中常用的通风流加培养法，将琼脂斜面试管内的纯种酵母经过数次逐级扩大增殖培养，再在发酵罐内增殖培养后，经过离心分离、压榨和干燥得到酵母产品。下图表示以糖蜜为原料生产面包酵母的流程。 分离多数酵母可以分离于富含糖类的环境中，比如一些水果（葡萄、苹果、桃等）或者植物分泌物（如仙人掌的汁）。一些酵母在昆虫体内生活。 用途最常提到的酵母酿酒酵母（也称面包酵母）(Saccharomyces cerevisiae)，自从几千年前人类就用其发酵面包和酒类，在酦酵面包和馒头的过程中面团中会放出二氧化碳。 在医药工业中，酵母及其制品用于治疗某些消化不良症，并能提高和调整人体的新陈代谢机能。因此，药用酵母的生产在酵母工业中占有重要的地位。 因酵母属于简单的单细胞真核生物，易于培养，且生长迅速，被广泛用于现代生物学研究中。如酿酒酵母作为重要的模式生物，也是遗传学和分子生物学的重要研究材料。 危害有些酵母菌对生物或用具是有害的，例如红酵母(Rhodotorula)会生长在浴帘等潮湿的家具上；白色假丝酵母（或称白色念珠菌）(Candida albicans)会生长在阴道衬壁等湿润的人类上皮组织。 酵母菌在畜牧业中，酵母广泛用作精饲料以增加饲料中的蛋白质含量,对提高禽畜的出肉率、产蛋率和产乳率,对肉质的改良和毛皮质量的提高均有明显的效果。 ①菌种：用于生产面包酵母的菌种为酿酒酵母。用于生产食品酵母和药用酵母的菌种有酿酒酵母和葡萄汁酵母。用于生产饲料酵母的菌种有产朊假丝酵母和脆壁克鲁维酵母，后者也可用于生产食用酵母和用于制备酵母自溶物等产品。 ②原料：主要是甜菜糖蜜（见甜菜制糖）、甘蔗糖蜜（见甘蔗制糖）和粮食原料。甜菜糖蜜含糖量高（还原糖50％左右），生产出的酵母颜色较浅。由于其含有不能被酵母利用的甜菜碱，因此酵母废水中的生物需氧量(BOD)较 高。甘蔗糖蜜的含糖量稍低于甜菜糖蜜,酵母生长时必需的生物素含量较高，灰分含量也较高。生产酵母时，如能采用80％甜菜糖蜜和20％甘蔗糖蜜，得到的酵 母无论在质量上还是数量上都比较好。但不论何种糖蜜都含有妨害酵母生长和繁殖、影响最终产品质量的杂质，必须经过处理才能用于生产。常用的处理方法有硫酸或磷酸加热处理澄清法。糖蜜稀释后，加少量酸并升温到90～100℃，在该温度下维持0.5～1.0小时,然后加石灰乳中和至糖液的pH为5.0左右,用 自然沉清法或机械分离法得到澄清的糖液供酵母生长和繁殖用。 玉米、小麦和土豆等也可作为生产酵母的原料。但由于酵母不能直接利用淀粉，必须用酸或酶法将淀粉水解为糖。由于淀粉水解和其它因素的影响，培养酵母的条件亦与糖蜜不同。此外，亚硫酸纸浆废液、木材水解液、乳清以及酒精废液和味精废液等都可作为生产饲料酵母的原料。苏联等国利用正烷烃和 甲醇等石油加工产品作为生产饲料酵母的原料。 为了保证酵母生长繁殖,除供应上述的碳源外,还必需添加一定量的营养盐如磷酸铵、硫酸铵、硫酸镁、氨水和尿素等作为氮源和磷源。为了使面包酵母具有高的发酵力,添加的氮源与磷源量应有一定的比例。此外,生物素、泛酸、肌醇和硫胺素等都是酵母生长和繁殖的基本要素，可根据产品的种类及所用的原料加以适量补充。 ③增殖培养:从实验室的斜面试管纯种开始,在严格的无菌条件下，经三角瓶(500～5000ml)、卡氏罐(10l)、种母罐 (500～10000l)等逐级扩大培养,使酵母细胞量成倍增加,然后将种母罐内的酵母作为种母接入发酵罐,用通风流加培养法得到酵母，称为第一代酵母。继续用这种酵母为种母进行培养得到第二代酵母。用同样方法得到第三代酵母即为商品酵母。从三角瓶培养到种母罐培养一般采用12°Be′麦芽汁为培养基， 30℃微量通风培养12～24小时。如种母罐较大，可采用部分麦芽汁和部分糖蜜为培养基，30℃通风培养12～14小时，培养结束时，用显微镜检查酵母的 生长情况，酵母细胞应大小均匀，强壮，无杂菌。一般500l种母罐内培养可得到鲜酵母约5kg（以压榨酵母计）。 商品酵母的繁殖是在发酵罐 (50～200m3)内用通风流加培养法进行。将种母罐内的酵母加入发酵罐与一定量水混合成一定浓度，在通风条件下将糖液和营养盐按比例流加，30℃培养12～18小时。培养过程中残糖量控制在0.10～0.50g/100ml,并用氢氧化钠或碳酸钠调节培养液pH为4.5±0.5范围。通风量随发酵罐类型、培养条件及酵母种类而异，一般为1:1左右,即每分钟通入与发酵培养液体积 等量的空气。培养过程中产生的泡沫用食用油或合成消泡剂消泡。培养结束时，酵母浓度一般为4～6％（干基计）。在理想条件下,酵母细胞可在2.5小时内成 倍增长，可将100g糖转化为56.7g干细胞物质。 ④分离和压榨：酵母繁殖培养阶段结束后，用离心机将酵母从发酵液内分离出，用水将酵母乳洗涤2～3次，除去发酵液内酵母代谢副产物、 杂质和杂菌等。一般最终酵母乳内含有18～20％酵母(以压榨酵母计)。如酵母乳的颜色较深，可增加水洗涤次数和水量，或添加少量的酸至洗涤水中以增加洗涤效果。正常的酵母乳为乳白色或略带米黄色。酵母乳再经板框压滤机或真空转鼓过滤机脱水。脱水后的酵母成饼状，水分含量为70～73％，加入少许食油及调 整水分后，经挤压机挤压成一定形状和重量的块状产品（如50g和500g）,用蜡纸包装成为产品，在0～4℃贮藏、销售。 ⑤干燥：将鲜酵母制成活性干酵母的干燥是技术要求很高的过程，要避免酵母在干燥过程中受热而丧失发酵力。传统的干燥方法是先将鲜酵母挤压成圆柱形(2～3mm长)后，在箱式干燥机内采用连续或间歇式干燥，热空气温度不超过40℃。此法所用设备简单，但干燥时间较长，发酵力损失较大。现采用此法生产活性干酵母的厂家已为数不多。 国际上普遍采用流化床干燥设备用于商品活性干酵母和快速活性干酵母的生产，分连续和间歇式两种。干燥过程中，酵母颗粒处于沸腾状态。干燥初期，酵母含水分较高，进入的空气温度可达100～150℃，酵母脱水速度较快；干燥后期空气温度应适当降低，使酵母温度始终维持在30～40℃ 之间，总的干燥时间约 1小时左右，随干燥机的形状、装料量、空气状况等而异。在干燥前，往鲜酵母内加入某些种类的乳化剂可以改善干醇母的再水化性能,增强酵母对热干燥的抵抗能 力,减少发酵力的损失。通常采用的乳化剂有单硬脂酸山梨糖醇酐、蔗糖酯和柠檬酸酯等，添加量为酵母干物质量的0.5～2.0％。为防止干酵母的氧化，亦可 添加少量的抗氧化剂如丁酰羟基苯甲醚等,添加量为0.1％。由于这些化合物的添加，使活性干酵母的贮藏稳定性大为改善。 食品酵母、药用酵母和饲料酵母的干燥较为简单。由于这些产品不要求保留酵母的发酵力，可采用离心喷雾干燥法和滚筒干燥法。

药学毕业论文开题报告篇3 题 目 名 称： 番泻叶对小鼠尿量的影响 研究现状： 一、普鲁兰酶 普鲁兰酶(Pullulanase，EC.3. 2. 1. 41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1.6糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的脱支酶。普鲁兰酶还可以分解普鲁兰多糖，普鲁兰酶来源于微生物，R-酶则来源于植物。普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气气杆菌Aerobacter. aerogenes}(典型菌为肺炎克雷伯氏杆Klebsiella.pneumoniae)发酵获得，他们报道了该酶良好的酶学性能。之后，各国的科研人员经过广泛深入研究，从不同的地区、微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。 在淀粉加工工业中，α淀粉酶最为常用，它的功能是水解淀粉的α-1,4糖苷键，单独用它时，产物中含有大量分支结构的糊精，其中就含有大量的α-1,6糖苷键。假如不把淀粉的α-1,6糖苷键彻底分解的话，势必会造成很大的浪费。自然界中，存在有能分解淀粉的α-1,6糖苷键的酶，通称为解支酶。如寡α-1,6葡萄糖苷酶( E.C3.2.1.68, Oligo-l,6-glucosidase )，普鲁兰酶(E.C3.2.1.41Pullulanase )，异淀粉酶( E.C3.2.1.68, Isoamylose )，支链淀粉一6-葡聚糖酶( E.C3.2.1.69,Amylopectin-6-gluanohydrase )，其中普鲁兰酶要求的底物分子结构最小，故而可以将最小单位的支链分解，导致可以最大限度的利用淀粉，所以在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。故而许多国家都争相开发，但是到现在为止，只有丹麦的NOVO公司具有普鲁兰酶的生产能力。我国只有向其进口，但是其价格昂贵，限制了普鲁兰酶在我国的应用。其实，我国早在七十年代就开发普鲁兰酶的产生菌，但是该菌的酶学性质不适合生产，至今我国在普鲁兰酶的国产化方面还没有报道。 在淀粉的加工行业上，对普鲁兰酶的酶学性质的要求是耐酸耐热，其原因是因为通常使用外加酶化法，由于所用酶类的限制，普鲁兰酶的添加可以在两步反应的任何一步，但必须满足上述的反应的条件。因此所开发的普鲁兰酶的酶学性质必须满足现有的酶法水解制糖的条件，也就是耐酸耐热。 二、普鲁兰酶的研究现状 1.产普鲁兰酶的微生物 普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气杆菌(Aerobacter aerogenes)发酵获得。他们报道了该酶的良好性能之后，各国的科研人员经过广泛深入的研究，从不同的地区的微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。但是迄今为止，尽管发现许多微生物能够产普鲁兰酶，但是由于当今工业生产条件(酸性，温度)，大多数微生物所产的普鲁兰酶并无商业价值。以下便介绍一下普鲁兰酶的生产菌种。 1.1蜡状芽抱杆菌覃状变种(Bacillus cereus Var.mycodes) 由日本的ToshiyukiTakasaki于1975年发现。该菌同时产生两种淀粉酶:β-淀粉酶和普鲁兰酶。最佳作用条件为pH6～6.5，温度50℃，最大转化率(淀粉水解产生麦芽糖)大约为95%.酶学研究中发现，此酶在pH5，温度60℃依然保持大部分活性，该菌的营养细胞呈棒杆状，聚集成长短不等紊乱链状，无运动性，格兰氏阳性，产芽抱时细胞无明显膨胀。该菌最适生长温度30℃～37℃ ,最高生长温度在41℃～45℃，可以利用葡萄糖，甘露糖，麦芽糖，海藻糖，淀粉和糖原。 1.2嗜酸性分解普鲁兰多糖芽抱杆菌(BaciIluS.Acidopullulyticus) 上世纪八十年代初，丹麦Novo公司获得此菌，此菌所生产的普鲁兰酶耐热 (60℃)，耐酸(pH4.5)。该公司经过投入巨资开发研究，1983年Nov。公司在日本和欧洲市场同时商业化销售，商品名Prornozyme。如今，它是应用最广，产量最大的普鲁兰酶。Bacillus.Acidopullrrlyticus呈棒状，深层发酵几小时后，可观察到类原生质体的膨胀细胞，较稳定，饱子呈圆柱体或椭圆体。格兰氏反应阳性，37℃生长良好，45℃以上和pI-1高于6.5以上不长，在以普鲁兰糖为碳源的培养基((pH4.8 ～5.2)上生长良好。 1.3枯草芽饱杆菌(Bacillus subtilis) 1986年，日本的Yushiyuki Takasaki报道了一株能产生耐热耐酸普鲁兰酶的菌种，被命名为Bacillus subtilis TU。此菌种所产生的酶为普鲁兰酶和淀粉酶的混合物，可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽搪.水解普鲁兰糖为麦芽三糖，其中普鲁兰酶最佳作用pH为7.0～7.5，但在pH5.0时亦有约50%的酶活，此普鲁兰酶最佳作用温度60℃。 1.4耐热产硫梭菌(Clostridum Themosulfurogenes) 1987年.德国的E.madi等报道了一株能同时产a淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶的菌种:耐热产硫梭菌。该菌种所产普鲁兰酶有较广的温度适应范围(40℃～85℃)，在pH4.5～6.0有较高的活性，在如此广的范围内都有较强活力无疑将扩大该普鲁兰酶的应用领域. 1.5 Bacillusnaganoensis,Bacillus deramificans,Bacillus.Acidopullulyticus 上世纪九十年代，Deweer发现了普鲁兰酶产生菌Bacillus naganoensis;Tomimura筛选出Bacillus deramifrcans。这两株菌所产的普鲁兰酶的酶学性质与Bacillus. Acidopullulyticus的酶学性质相似。这两株菌都是中度嗜酸菌，在pH6.5以上就不生长，温度超过45℃以上同样也不生长。这两株普鲁兰酶产生菌的发现，进一步拓宽了普鲁兰酶的应用。 1.6产普鲁兰酶的高温菌菌种 自上世纪八十年代以来，人们逐渐意识到在通常的自然条件下，很难筛选得到极端耐热的普鲁兰酶生产菌种，于是各国的科学家便把目光转移到温泉嗜高温细菌的筛选，而且现在已经取得较多的成果。Bacillus如vorcaldarius所产普鲁兰酶的最适温度和pH分别是75～85℃, pH6.3, Thermotoga maritime的最适温度和pH分别是90℃, pH6.0, Thermurs caldopHilus的最适温度和pH分别是75℃,pH5.5, Fenidobacterion pernnavoran最适温度和pH分别是80～85℃, pH6.0o 2.普鲁兰酶的分子结构 至今为止，许多普鲁兰酶的基因己经被克隆，但是还没有见到任何有关普鲁兰酶结构的报道，但是在根据序列相似性对糖普键水解酶的分类，普鲁兰酶属于第13家族，α淀粉酶家族，这个家族中包含了30多种酶，可以分为水解酶，转移酶。异构酶三大类。这些酶能够水解和合成α～1.4,α～1.6,α～1.2,α～1.3,α～1.5,α～1.1糖苷键。其中很多酶的结构已经被报道，它们都采取了(β/α)8的结构，通过生物信息学的研究，这个家族的蛋白都有一个共同的结构，酶的活性中心都是(β/α)8折叠筒的结构，命名为结构域A。第13家族的大多数酶还具有结构域B，它是位于(β/α)8折叠筒中，第三个β片层与第三个α螺旋之间的一段序列，其特点是结构和长度差异较大，推测其功能是与底物的结合有关。在紧接着(β/α)8折叠筒后，还有C结构域，紧接C结构域，部分家族成员还有结构域D。 3.普鲁兰酶的应用 普鲁兰酶，在食品工业中是一种用途广泛的酶制剂和加工助剂。它能专一性分解淀粉中的支链淀粉和糖原分子及其衍生的低聚糖分支中的α～l, 6糖苷键，使分支结构断裂，形成长短不一的直链淀粉。因此，将该酶与 其它 淀粉酶配合使用时，可使淀粉糖化完全。近年来，普鲁兰酶己作为淀粉酶类中的一个新酶种，应用于淀粉为原料的食品等工业部门，在食品工业中有如下几方面的作用: 3.1单独使用普鲁兰酶，使支链淀粉变为直链淀粉 直链淀粉具有凝结成块，易形成结构稳定的凝胶的特性，因此，可作为强韧的食品包装薄膜。这种薄膜对氧和油脂有良好的隔绝性，又因涂布开展性好，故适合于作为食品的保护层。它还适合于淀粉软糖制造，也可用作果酱增稠剂，用于装油脂含量高的食品，以防止油的渗出以及肉食品加工。近年来在食品工业中提倡使用可被生物降解的薄膜，直链淀粉在这些方面具有较大的发展前途。豆类直链淀粉含量较高，因此绿豆淀粉制成的粉丝韧性比其它淀粉好，如果用普鲁兰酶处理谷物淀粉，再制成直链淀粉后，可以制成高质量的粉丝。一般谷物淀粉中，直链淀粉含量仅占20%，支链淀粉含量约为80%。工业上每生产1吨直链淀粉就有4吨副产品的支链淀粉。美国虽然通过遗传育种的方法.得到含直链淀粉60%玉米新品种，但不大适于大量生产。国外已采用普鲁兰酶改变淀粉结构，可使支链淀粉变为直链淀粉。据报道，采用此法收率可达100%.制造直链淀粉的方法为，先采用普鲁兰酶分解经液化的分支部分，使其转变为直链淀粉，并以丁醇或缓慢冷却法沉淀淀粉。再回收含少量水分的晶型沉淀物，最后通过低温喷雾干燥法制成粉状的直链淀粉。 3.2普鲁兰酶与β～淀粉酶配合使用生产麦芽搪 饴糖是我国传统的淀粉糖产品，其中所含部分麦芽糖，广泛用于糖果、糕点等食品工业。目前生产方法是以α～淀粉酶进行液化，再用β～淀粉酶水解支链淀粉，这样只能水解侧链部分。接近交叉地位的α～1.6糖苷键时，水解反应停止。但如果使用普鲁兰酶共同水解，便能使分支断裂，提高淀粉酶水解程度，降低了β极限糊精的含量，大大提高了麦芽糖的产率，有利于生产麦芽搪浆。目前对加普鲁兰酶进行糖化己作了较大规模的试验。 试验条件为。每批投料量约为900公斤碎米，粉浆浓度为15～16Be°数皮用量1.5%(对碎米计)，β～淀粉酶活性2,000单位/克以上，pH5.8;普鲁兰酶活性45,000～55,0 00单位/克，系由产气气杆菌生产，每批用量为1公斤。试验结果表明，加入普鲁兰酶糖化的试验糖与对照糖品相比，还原糖平均增加14.8，麦芽糖含量平均增加了45.6，糊精含量平均减少了26.7高浓度麦芽糖浆较之高浓度葡萄搪浆，具有不易结晶，吸湿性小的特点，所以高浓度麦芽糖浆在食品工业中有着广泛的用途。采用普鲁兰酶与p一淀粉酶配合使用，成本低廉，麦芽糖收率达到70%左右，其至更高。 3.3用于啤酒外加酶法糖化 啤酒生产中麦芽，既是酿造啤酒的主要原料，也为酿造过程提供了丰富的酶源。在啤酒酿造的糖化过程中，麦芽中分解淀粉的主要酶是α～淀粉酶、β～淀粉酶和分解淀粉α～1. 6糖瞥键的R一酶(植物普鲁兰酶或植物茁霉多糖酶)。β～淀粉酶与另两种淀粉酶协同作用，可使淀粉分解成麦芽糖(也包括少量的麦芽三糖和极少量的葡萄糖)和低分子糊精。使麦芽汁有比较理想的糖类组成。在工业生产中为了节约麦芽用量，采用所谓外加酶法糖化，即在减少麦芽用量的前提下，增加淀粉质辅助原料的比率，并加入适当种类的酶制剂进行搪化。要使大麦及其它辅助原料糖化完全，需要外加a一淀粉酶和分解α～1.6糖苷键的普鲁兰酶制剂等。单独使用a一淀粉酶时产生麦芽糖和麦芽三搪是很不完全的。假如分解淀粉α～1.6糖苷键的酶活性不足，淀粉分解就不完全，其结果是可发酵性糖含量低，制成的啤酒发酵度达不到要求。若采用能分解α～1.4和α～1.6糖苷键的糖化型淀粉酶，则其反应产物为葡萄糖，容易使酒味淡薄。采用普鲁兰酶与α～淀粉酶协同，效果良好，其分解产物主要是麦芽糖和少量的麦芽多糖。采用外加酶法糖化时，加入酶制剂的用量为:淀粉酶6～7单位/克大麦及大米:蛋白酶，60-80单位/克，并配合以菠萝蛋白酶10ppm，普鲁兰酶50单位/克大麦。以上三种酶制剂均添加于糖化或酒化开始。 总之，普鲁兰酶无论作为酶制剂和食品工业的加工助剂均有广阔的发展前途。 研究目的和意义： 酶制剂工业是上世纪七十年代就己经形成的一个重要的产业，目前世界酶制剂总产值达100亿美元，我国的产值约为100亿人民币，并且随着其应用领域的不断扩大以及新酶种的开发，这一市场正在迅猛发展。但是全球酶制剂产业几乎被几家外国公司所垄断，其中丹麦的NOVO公司几乎占全球总销售额的一半。本研究对普鲁兰酶的开发，对酶制剂产业的发展有重要的意义。 其次我国自从七十年代开始便对普鲁兰酶进行研究开发，但是所开发得到的普鲁兰酶，既不耐热也不耐酸，这就使其在工业化应用中受到了局限。为了改变我国对进口产品的依赖，填补我国这一领域的空白，寻找一条国产化的道路，本研究的目的是利用自然微生物资源，普鲁兰酶，提高我国淀粉原料的利用率，从而提高整个淀粉加工行业的生产率，这对我国淀粉加工产业的意义是不言而喻的。 研究内容(内容、结构框架以及重点、难点)： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集; (2)菌种初筛; (3)菌种复筛; (4)菌种保藏方法; (5)酶活力测定方法的建立。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响; (2)初始PH对发酵产酶的影响; (3)接种量对发酵产酶的影响; (4)发酵温度对产酶的影响; (5)金属离子对产酶的影响。 重点或关键技术： (1)纯菌株的分离; (2)菌株的鉴定方法的选择。 研究方法、手段： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集：选择适合产生的地点(面粉厂.菜地.果园等)采集土样 (2)菌种初筛：在采集的土样用无菌水稀释后，在含有淀粉类的培养基中做平板涂步， 37℃培养48h后，用碘液进行显色反应，将有淀粉酶产生的菌落接于斜面中保存。 (3)菌种复筛：将前期分离的能产生淀粉酶的菌株涂步于普鲁兰糖平板上，37℃培养48h后用95%乙醇进行透明圈实验。有透明圈产生说明菌株产生普鲁兰酶，将产生透明圈的菌落挑于斜面培养基培养。 (4)菌种保藏方法： 采用4℃低温保藏。 (5)酶活力测定方法的建立：采用发酵培养液经过离心后利用DNS显色法 520nm测定吸光值，测定标准葡萄糖标准曲线，利用标准曲线计算普鲁兰酶酶活大小。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响：采用不同碳源，氮源培养基培养一段时间，测定酶活力。(其他条件相同：接种量，装瓶量，初始PH值，转速，培养时间。) (2)初始PH对发酵产酶的影响：采用相同发酵培养基，在不同初始PH下接种等量种子液。在相同条件下培养，测定发酵液的酶活。(其他条件相同：接种量，装瓶量，转速，最佳培养温度，最佳培养时间。) (3)接种量对发酵产酶的影响：在发酵培养基中分别接入2%，4%，6%，8%， 10%，14%，18%的种子培养液于最佳碳源，氮源，最佳初始PH的培养基中，在相同条件下培养，分别检测酶活。(采用以上确定的最佳碳源，氮源，最佳初始PH。) (4)发酵温度对产酶的影响：采用相同培养基，在不同温度下(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)培养一定时间，测定酶活力。 (5)金属离子对产酶的影响：在基础培养基中加入少量不同金属离子，发酵后测酶活。(金属离子有： 锰离子，钙离子，锌离子，镁离子，铁离子，铜离子。) 研究进度 ：完成项目总体进度30%，样品土样的采集及前期的准备工作,菌株的初筛，包括(样品土样原液的涂步培养及摇床培养，产支链淀粉酶菌株的挑选及斜面培养)。 ：完成项目总体进度50%,菌株的复筛，包括(产普鲁兰酶菌株的筛选及斜面培养),葡萄糖标准曲线的测定,酶活测定方法的建立,并以酶活大小对菌株进行再次筛选。 ：完成项目总体进度80%,产酶条件的研究。包括：碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。并通过各中单因素试验确定发酵培养基的最佳碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。 2009、4—2009、5 ：完成项目总体进度100%,课题总结，撰写论文。 文献综述(包括：国内外研究理论、研究方法、进展情况、存在问题、参考依据等) 自从1961年Bender H.等人在研究一株产气气杆菌Aerobacter aerogenes(典型菌为肺炎克雷伯氏杆菌Klebsiella.pneumoniae)时首次发现普鲁兰酶后，国际上对产生这种酶的微生物进行了广泛研究，发现许多微生物可以产生此酶，并筛选出一些适用于工业化生产的优良菌株。随着该酶的应用发展，对耐热性普鲁兰酶的研究也逐渐增多，已成功克隆并表达了该酶的基因。国内1976年开始对一株产气气杆菌(Aerobacteraerogenes 10016)的普鲁兰酶进行研究，对该菌株的产酶条件、酶的分离提取及酶学性质作了报道，并研究了该酶的食品级提取技术。此外，陈朝银、刘涛等人从云南温泉水样中筛选到一株产普鲁兰酶高温栖热菌菌株，通过诱导等实验将该酶的酶活从0.069u/mL提高到170u/mL，酶产量提高了近2500倍左右，酶的最适作用温度及pH分别是75℃和4.5，具有一定的耐热和耐酸特性。 陈金全等从温泉水样中筛选到一株产耐热耐酸普鲁兰酶的野生菌株，并根据形态、生理生化特征、细胞化学组分分析及16SrDNA序列比对、基因组DNA的G+C摩尔百分含量、同源性比对等实验，鉴定其为脂环酸芽抱杆菌属(Alicyclobacillus)的一个新种，所产酶最适作用温度为60℃，最适pH值4.0，具有较好的耐热耐酸特性。杨云娟等利用毕赤酵母成功构建了普鲁兰酶表达量较高的基因工程菌，摇瓶发酵酶活可达350.8U/mL，最佳发酵条件下产量可达504.5-510.1U/mL .酶的最适作用温度为600C，最适pH值4.5，具有较好的耐热耐酸性。目前我国仍没有具备独立生产普鲁兰酶能力的厂商，要实现低成本、国产化的生产，还有很长的路要走。 技术应用于耐热脱支酶的研究，使耐热异淀粉酶的研究有了很大发展。Coleman等人将嗜热厌氧菌T. brockii普鲁兰酶基因克隆到B.subtilis中得到的克隆子分泌的普鲁兰酶数量高于出发菌株，Okada等人将Bacillus Steanther, onhiu:中编码热稳定异淀粉酶的基因克隆到B.subtilu:中，得到的转化菌株其异淀粉酶能在60 ℃稳定15分钟。Burchadf将。ostridium thermosulf urogenes DSM38%的嗜热异淀粉酶基因克隆并在E.coli中表达，所得酶的最适pH和最适温度与出发菌相同，而且在高温下仍能保持活性.Antranikiam等人将Pyrococcus舟riousous的异淀粉酶基因克隆到E.coli中并分离得到了酶蛋白。尽管如此，目前尚未有已将转基因的耐热性异淀粉酶工程菌应用到工业生产中的报道。众所周知，利用物理和化学诱变剂单独或复合处理微生物细胞是选育高产变种菌株行之有效的经典方法，它在为培育多种抗生素、氨基酸、核苷酸激酶(尤其是蛋白酶和淀粉酶)的高产变种菌株方面曾经起过极为重要的作用，至今仍然是方便易行和行之有效的方法之一。 主要参考文献： [1][美]惠斯特勒等编王雏文等译.淀粉的化学与工艺学[M].北京：中国食品出版社，1988 [2]张树政.酶制剂工业[M]. 北京: 科学出版社，1998 [3]邬显章.酶的工业生产技术[M]. 吉林: 吉林科学技术出版社，1988 [4]Taniguchi H, Sakano Y, Ohnishi M, Okada G(1985) Pullulanase[J].TanpakushitsuKakusan Koso. 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