农业生物技术学报杜仲

《农业生物技术学报》（Journal of Agricultural Biotechnology）由中华人民共和国教育部主管，中国农业大学、中国农业生物技术学会

考研吗？如果考研的话，都是基础知识，初试阶段跟导师没什么关系，也不用找他们的论文；复试阶段也是考察基础知识，而且录取后选导师是双向选择，复试时，面试你的老师不一定是谁，所以个人认为，不要把精力放到这里，重在基本、基础知识、基本实验技能。

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一、植物的遗传转化 20世纪70年代末80年代初，人们用野生型Ri和Ti质粒转化烟草和马铃薯细胞获得再生植株后，以Ti质粒为载体的植物遗传转化技术随之被建立。近年来植物的遗传转化技术得到了迅速发展，建立了多种转化系统。按照基因引入受体植物细胞的方法，植物遗传转化技术大体可分为两类：以载体为媒介的基因转移和基因或DNA的直接转移。所谓以载体为媒介的基因转移就是将目的基因连于某一载体DNA上，然后通过寄主感染受体植物等途径将外源基因转入植物细胞的技术。DNA的直接转移是指利用植物细胞生物学特性，通过物理、化学和生物学方法将外源基因转入植物细胞的技术。 （一）载体法转化 农杆菌介导的转化是最主要的一种载体转化方法。利用经过改造的农杆菌Ti质粒为载体可以高效地转移外源基因。所获得的转化植物有两种基本方法：一种是1979年Marton等以植物原生质为受体的共培养法（ocultivation）；一种是1985年Horsch等人建立的叶盘法（leaf disc cocultivation）。 共培养法是把农杆菌与植物原生质体共同培养以实现转化的方法。其程序包括农杆菌对初生细胞壁的原生质体的转化、转化细胞的筛选和诱导转化细胞分化并再生植株。 叶盘法实际上是对共培养法加以改进后而创立的一种转化方法。用农杆菌感染叶片外植体并短期共培养。在培养过程中，农杆菌的vir基因被诱导，它的活化可以启动T-DNA向植物细胞的转移。共培养后，也要进行转化的外植体的筛选、愈伤组织的培养、诱导分化等步骤，以得到再生植株。叶盘法由于不需进行原生质体操作等，方法简单，获得转化植株也更快，是用植物外植体为材料进行转基因的一个良好途径。 农杆菌介导的遗传转化是大多数双子叶植物转化中常采用的方法，但由于农杆菌具有宿主局限性，极少能感染单子叶植物，特别是一些重要的农作物如水稻、小麦、玉米等对农杆菌不敏感，难于应用此法进行遗传转化。 除上述以Ti质粒为载体的基因转化外，还可以用脂质体（liposome）为载体进行遗传转化。脂质体是由磷脂组成的膜状结构，因此可将DNA分子包装在脂质体内以避免受体细胞DNase的降解，把DNA分子导入到植物的原生质体中去。 （二）基因直接转移的方法 这是指既不依赖于农杆菌，也不依赖其他载体或媒介的一些基因转移方法。 1．电激和电注射法 电脉冲能改变细胞膜的透性。通过高压电脉冲的电激穿孔作用把外源DNA引入植物原生质体的方法就称为电激法（electroporation）。这种方法现已较广泛地应用于单子叶和双子叶植物以及动物的基因转移，如20世纪80年代末用此法将新霉素磷酸转移酶（NPT Ⅱ）基因转入玉米自交系的原生质体，已再生成植株。 通过电激技术把基因直接引入完整的植物细胞或组织的方法，称作电注射（electroinjection）。这种方法可避免原生质体培养和再生成植株的繁杂操作与困难，因而具有巨大的应用潜力。 2．基因枪法 基因枪法又称粒子轰击技术（particle bombardment）。这一方法是用粒子枪把表面吸附有外源DNA的金属微粒高速地射进植物细胞或组织。由于此法快速简便，不受宿主范围限制，而受体植物细胞不需去除细胞壁，转化率又高，被转化的细胞或组织容易再生成植株，因而颇受关注。 3．微注射法 微注射法（microinjection）是利用显微注射仪等，通过机械的方法将外源基因或DNA直接注入细胞核或细胞质。与其他方法相比，这个方法对外源遗传物质的导入更为直接和有效。 微注射法除用于植物细胞外，近些年还发展到用于直接注射植物子房，这样更有利于外源遗传物质对幼胚的转化。这方面的工作我国于20世纪70年代即已进行了理论与实践的探索，并已获得抗枯萎病的棉花转化植株抗虫棉等。 二、转基因动物技术及其应用 （一）转基因动物的概念 借助基因工程技术把外源目的基因导入生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体染色体上稳定整合，使之经过各种发育途径得到能把外源目的基因传给子代的个体，即转基因动物（transgenic animal）。转入的目的基因称为转基因（transgene），这种转移目的基因的过程称为转基因作用（transgenesis）。关于“转基因”的概念，通常只限于动、植物中经基因工程技术进行的基因转移，因此品种间不论有性或无性杂交获得新基因的途径都不属此范畴。 （二）转基因动物技术 转基因动物技术是20世纪80年代初发展起来的一项生物技术，它克服了物种之间的生殖隔离，实现了动物物种之间遗传物质的交换和重组。根据外源基因导入的方法和对象的不同，至今主要有3种途径可以产生转基因动物，即显微注射法、反转录病毒法和胚胎干细胞法。反转录病毒转移基因的基本方法在前面已有简介，这里只介绍显微注射法和胚胎干细胞法两种。 1．受精卵原核显微注射法 显微注射技术是从动物胚胎学研究移核实验的基础上发展而来。20世纪80年代初期人们利用这一方法向动物生殖细胞转移外源基因，成功地建立了转基因小鼠。1985年转基因绵羊和转基因猪问世，以后转基因大鼠、兔、鸡、牛、鱼等都已陆续取得成功，可见显微注射法是迄今应用得较为普遍而又最有成效的一种获得转基因动物的技术。 本方法是在显微镜下，用直径约为1μm的玻璃管直接插入受精卵的雄原核内，将毛细管内所带有的外源基因的DNA注入原核，然后将其移植到假孕母体输卵管或子宫内并发育成子代个体。为了解转基因的整合情况，可酌情应用斑点杂交、多聚酶链式反应或Southern印迹杂交等方法对子代个体DNA进行检测。 显微注射法的优点是导入的外源基因片段可长达50 kb，且无需载体，外源基因在宿主染色体上的整合率相对较高。其不足之处是外源基因的整合是随机的，因而难以控制其整合率；再者，对外源基因能否稳定整合于受体基因组的检测，必须等到子一代个体出生后经过选择才能确定，不利于在生育期长、产仔少的大家畜中应用。 2．胚胎干细胞介导法 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是指从哺乳动物胚胎囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的多能性，能够分化出各种组织。20世纪80年代中期人们开始研究利用ES细胞获得转基因动物的方法。这个途径是将外源基因直接导入ES细胞，经体外培养筛选后再注入到受体囊胚腔中，与其中的囊胚细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分，参与其分化。由这种胚胎发育而成嵌合体的转基因动物，即其中有一部分组织来源于整合有外源基因的供体ES细胞。在嵌合过程中，被转化的ES细胞分化而成的生殖细胞可通过杂交将引入的外源基因传递下去。 在以胚胎干细胞为媒介获得转基因动物的技术中，既可以用多种方法将外源基因导入ES细胞，且细胞的鉴定、筛选比较方便，又可预先在细胞水平上测定外源基因的拷贝数、定位和表达的水平以及插入的稳定性等，而且将ES细胞注入囊胚的操作较易进行，整合率相对较高。只是建立ES细胞系本身就是一项难度极高的工作，目前小鼠ES细胞系虽已建立，但在猪、羊中还未能得到真正稳定的ES细胞株。 （三）转基因动物的应用 转基因动物的研究内容非常广泛，20世纪80～90年代以来从基础理论到应用技术在深度和广度上都有了很大发展，并已日渐由实验室走向生产实践。 1．在基因表达调控研究方面的应用 利用转基因动物可作为在体内研究外源基因表达调控的“反应器”，下面仅就DNA顺式调控元件和基因在发育中的时空调节为例予以介绍。 （1）顺式调控元件的研究 异常的脂蛋白水平与动脉粥样硬化等疾病有关。人类有5种脂蛋白，各自含有不同的载脂蛋白。现已发现约有17种载脂蛋白，它们的编码基因已测序，是用于研究心血管疾病的候选基因。把载脂蛋白基因转入小鼠，可用来研究人脂蛋白代谢、调控以及动脉粥样硬化。在研究载脂蛋白基因组织特异性表达的顺式调控元件时，发现有两簇载脂蛋白基因凋节的组织特异性表达（图19-15）。一簇包括A－Ⅰ、C-Ⅲ和 A-Ⅳ基因，定位于人11号染色体长臂2区3带（11q23），是按A－Ⅰ、C－Ⅲ、A－Ⅳ的顺序组成。C－Ⅲ的转录方向与其他两个基因相反。 A-Ⅰ和C-Ⅲ主要在肝和小肠中表达，A-Ⅳ主要在小肠表达。在 C-Ⅲ基因的-0.2～-1.4bp之间是调节 A－Ⅰ基因在小肠中表达的区域。这个区域也是 C－Ⅲ和A－Ⅳ基因在小肠表达的凋控元件，表明这一元件可以调节整个载脂蛋白基因簇在小肠的表达。另一基因簇定位于19号染色体长臂1区3带（19q13），包含有E、C－Ⅰ和C-Ⅱ基因，它们按E、C－Ⅰ、C－Ⅱ顺序排列。E基因主要在肝脏和大部分身体组织中表达，但表达水平低。以后发现在C－Ⅰ基因和C－Ⅱ基因之间有一调控区可使E基因在肝脏内高水平表达，该区长约154 bp。此外，还证实这个调控区也调节该座位其他两个载脂蛋白基因 C－Ⅰ和 C－Ⅱ在肝脏的表达。的表达。 （2）与发育相关基因的表达与调控 用转基因动物可研究基因在发育中的时空调控。珠蛋白基因是研究发育调控的最好例子。人类珠蛋白基因分为α、β两簇，分别定位于16号和11号染色体，各长30kb和60kb。据1993年的报道，为分析完整的β-珠蛋白基因中人的珠蛋白基因的开关调控，Peterson等把一个含有248 kb长的人β-珠蛋白基因簇的酵母人工染色体（YAC）转入小鼠。对转基因小鼠中此基因簇的表达分析表明，在成年的转基因动物中只有人β-珠蛋白表达；在子一代和子二代动物中证实YAC β座位有β样珠蛋白基因的发育开关调控，即在卵黄囊中有ε-和γ-珠蛋白基因表达，在14天的肝脏中有少量γ和大量β表达，而在成年动物中则仅有β珠蛋白基因的mRNA表达。采用先在酵母细胞内通过同源重组的方式使YAC发生突变，然后把这种突变的YAC导入小鼠，就可以详细研究整个座位上基因的调控机制，如珠蛋白基因在发育与分化中的基因表达、定点诱变的β基因对发育凋节的影响等等。 除前述有关基因表达凋控的研究外，把转基因动物用于遗传病动物模型的研制近年来发展也很快，如把pro-αⅠ胶原突变基因导入小鼠基因组，可产生类似人的骨发育不全症的转基因小鼠，这对了解人类遗传病的发病机理意义重大。 2．用于基因产品的制备 在转基因动物中，导入的目的基因表达，人们就可以从该动物的乳汁和血液里获得目的基因产物，因此，可把转基因动物看作是一种个体表达系统（whole animal expression system），以制备某种基因产物。这样的转基因动物常被称作动物生物反应器（animal bioreactor）。 1982年Palmiter把大鼠生长激素基因转入小鼠，成功地获得高效表达生长激素的小鼠，其体积明显增加，证实了用转基因动物生产外源基因产品的可行性。近年来的报道已证实在转基因家畜（如猪）的乳腺中可高效合成自身不含有的异源蛋白，如乳清蛋白等。目前，英国正在研究通过羊β-乳球蛋白启动子和乳清蛋白启动子的控制，在转基因羊体内表达人α1抗胰蛋白酶和凝血因子Ⅸ；在美国已有在转基因小鼠、乳羊和乳牛乳汁中分别表达产生tPA和促性腺素的研究报道。我国利用转基因动物为反应器生产基因制品的工作也在展开，最近有关单位已从转基因羊乳汁中获得促红细胞生成素。 3．动物品种的培育与改良 把具有优良性状的基因或抗病基因导入畜禽以培育新的品种，这是转基因动物研究中的一个极重要的方面。如已培育出抗鸡白细胞组织增生病毒的转基因鸡新品种。为增强鱼类的抗冻性，已有抗冻蛋白基因在转基因鲑鱼中表达的报道。1985年我国学者朱作岩在国际上首次将小鼠MT／hGH融合基因注入金鱼受精卵中，获得转基因金鱼，其F1比转基因鱼的同代大两倍。以后该类实验中还陆续获得其他鲫、鲤等几种转入生长激素基因的鱼。 三、转基因技术研究进展 （一）基因分离技术的发展 真核生物基因组非常大，巨遗传背景常不清楚，要从这样庞大的DNA中分离目的基因实非易事。但是由于生物化学、酶学、分子生物学等学科的迅速发展，为基因的分离提供了有效手段，如今已发展了一些新的分离目的基因的技术，如PCR、转座子标签法与基因组消减技术等。 1．转座子标签技术 基因发生转座最重要的遗传效应是引起插入突变，也就是使插入位置的基因失活并诱导产生突变型，或在插入位置上出现新基因。因此，可用转座子作探针克隆出该突变基因，再用突变基因作探针，从野生型个体中分离并克隆出野生型基因。这种用转座子来分离基因的技术称为转座子标签技术（transposon tagging）（图19－16）。这种技术的一个显著特点是可以用来分离预先不清楚表达产物的基因。目前已可利用在分子水平上研究得较为清楚的转座子系统如玉米的Ac／Ds、金鱼草的Tam3等来分离异源植物的基因。 利用转座子分离植物基因时，首先要构建含转座子与质粒载体，因为已分离得到的转座子与选择标记需整合到适当的质粒基因组中才能用于目标植物的遗传转化。当前用于构建转座子载体的质粒主要是根癌农杆菌的Ti质粒和pBR322等。其次是目标植物的遗传转化，现常用带有载体系统的根癌农杆菌进行转化。第三是转座及拷贝数的检测。最后是转座子插入突变的检测及分离。而对分离得到的突变体，还要证明其突变确系转座子的插入所引起的。 近几年，一些用传统生化方法难以分离的基因已用转座子标签法分离出来，如金鱼草中控制花瓣及雄蕊发育的基因，与花的发生、发育有关的基因，亚麻的抗锈基因等。美国、荷兰等国也分别利用转座子分离拟南芥菜种子中脂肪酸合成的基因和研究植物病原体的抗性。 2．基因组消减技术 基因组消减（genomic subtraction）技术是最近几年在PCR基础上发展起来的根据表型变异进行目的基因分离和鉴定的又一种方法，已被应用于动、植物中分离遗传背景不十分清楚的基因，如在医学研究中已将该技术用于分离和鉴定肿瘤缺失和重排基因、制备多态位点探针、分离遗传性疾病基因和基因治疗等领域。 运用消减杂交技术分离缺失序列的概念最早是由Buatz提出的，他利用T4噬菌体缺失突变株的DNA来分离相应缺失区域的mRNA并获得成功。以后被许多实验室引用并加以改进。1989年D．Stuars和L．Wieland分别将PCR技术引入消减杂交方法中，使基因组消减杂交技术得以推广应用。这一技术的基本原理是先用γ射线等引起机体大片段DNA的缺失突变，然后用此突变体DNA与野生型DNA杂交，用以去除野生型中突变体的DNA。如此反复几次，在反应体系中突变体DNA所缺失的那段亲本DNA序列便被保留下来。采用生物素-亲和素-磁珠系统或HAT结合生物素-亲和素层析系统富集缺失这种序列并用PCR技术扩增。扩增的序列再用来与野生型基因文库杂交，从而克隆到对应缺失性状的基因（图19-17）。 用基因组消减杂交技术目前已从拟南芥中成功地克隆到包含赤霉素GA1位点的基因。在医学研究中也有通过基因组消减杂交技术克隆人染色体特异的基因探针的报道，如杜兴式肌营养不良（duchenne muscular dystrophy，DMD）和脉络膜缺损（choroideremia）座位的探针。 （二）基因剔除技术 基因剔除（gene knock-out）技术又称基因打靶技术（gene trageting），是20世纪80年代末发展起来的。这是利用同源重组的方法以建立基因定点灭活细胞系或获得基因定点灭活动物。这一技术近年来应用于生物学的诸多研究领域，已获得数百种基因定位缺陷小鼠。 基因剔除技术的原理首先是用基因重组方法在目的基因片段中插入一外源基因作为筛选标记基因并使目的基因失活（定点突变），再将此（灭活）基因转入胚胎多能干细胞（ES细胞）中，通过细胞内的基因同源重组使灭活基因取代染色体上原有的目的基因。经筛选和基因型鉴定后，把定点突变后的ES细胞注入宿主囊胚腔内，然后将胚胎植入假孕母体子宫，使其发育成目的基因缺陷（突变）的嵌合体，经子代自交后筛选出目的基因缺陷的纯合子即基因剔除动物。 基因剔除的具体实验步骤是：首先要进行同源重组载体的设计与构建，即选择具有一定长度（5～7kb以上）与目的基因功能区域同源的序列，并插入选择性标记基因（如新霉素抗性基因neo等），以便于筛选。在此同源序列的一端或两端还可以连接上负筛选标志基因（如单纯疱疹病毒胸苷激酶基因等）。用电转染等方法将此同源重组载体转染靶细胞。通过药物抗性来筛选重组细胞克隆，并用PCR和Southern杂交等方法对重组细胞进行基因型鉴定，这时得到的就是单个等位基因被剔除的杂合子细胞。为建立等位基因双剔除的细胞系，则还要将单个等位基因剔除的细胞大量传代培养，然后在更高浓度的选择性培养基中多次重复筛选，并对最终得到的阳性克隆进行基因型鉴定。 在应用上，通过探讨目的基因突变在基因剔除动物个体发育中的时空效应以及分析体内单基因缺陷所产生的表型异常，可以研究基因功能和调控，建立疾病的动物模型和基因治疗等。因此，在细胞水平进行基因剔除研究有非常重要的意义。如近几年国外已报道建立了用于研究心血管疾病的载脂蛋白E（apoE）、低密度脂蛋白受体的基因剔除动物。 基因剔除细胞系的建立有可能直接发现特定基因剔除后的影响，阐明基因功能，制备基因缺失的细胞模型，用于发病机理或基因治疗的研究。体细胞与ES细胞同源重组有所不同，后者一般只需将同源染色体等位基因之一灭活，就能在嵌合体后代中最终获得纯合的基因剔除动物。而在体细胞水平灭活特定基因就必须把一对等位基因都灭活，否则无法研究其功能。目前采用两种方法都可成功地达到这一目的：一是用两种带有不同标记基因的同源重组载体分别对靶细胞进行两次同源重组；另一是把单个等位基因灭活的细胞系传代培养，提高标记基因产物抗药物的浓度，利用标记基因表达的累加效应，筛选出细胞系中自然发生的双等位基因被剔除的细胞克隆。