乙酰胆碱酯酶突变研究进展论文

有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂主要的作用是对乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，简写AChE）产生抑制作用。突触部位大量乙酰胆碱积累，突触后膜的乙酰胆碱受体不断地被激活，突触后神经纤维长时期处于兴奋状态。同时，突触部位正常的神经冲动传导受阻塞，中毒的昆虫最初出现高度兴奋、痉挛、最后瘫痪、死亡。

1．乙酰胆碱酯酶的生物学

AChE是一水解酶，底物是乙酰胆碱，水解反应式如下：

有两种胆碱酯酶：

第一种，乙酰胆碱酯酶（AChE），又称真胆碱酯酶或者称专一性胆碱酯酶。由于来源于红血球，又称为红血球胆碱酯酶。这个酶的特点：①乙酰胆碱是它的最好的底物；②它表现有过量底物时才产生抑制作用，即增加底物浓度，水解速率不断地增加，当底物浓度达到10-2.5mol/L时，水解速率才下降。

第二种，丁酰胆碱酯酶，又称假胆碱酯酶或者称非专一性胆碱酯酶。由于来源于血浆，所以又称为血浆胆碱酯酶。过去也称做胆碱酯酶，与乙酰胆碱酯酶容易混淆。丁酰胆碱酯酶的特点：①丁酰胆碱是它最好的底物；②不表现过量底物的抑制作用，即底物在极低浓度时（低于10-4mol/L）即对丁酰胆碱酯酶产生抑制作用，水解速率明显下降。因此，丁酰胆碱酯酶对抑制剂非常敏感。例如，马血浆中的丁酰胆碱酯酶比马红血球中的乙酰胆碱酯酶对四异丙基八甲磷敏感性大11300倍。

在脊椎动物中两种胆碱酯酶都很普遍。乙酰胆碱酯酶被发现在红血球、神经及肌肉组织中。动物中乙酰胆碱酯酶受到抑制时，达到一定程度即引起动物死亡。丁酰胆碱酯酶在动物的血浆、肝及神经组织中很普遍，但是，丁酰胆碱酯酶受抑制时不会引起动物死亡。在动物（包括人）的血浆中丁酰胆碱酯酶的活性，可以作为动物药物中毒程度的指标。

在昆虫及哺乳动物中发现一种大分子质量的胆碱酯酶，具有一般乙酰胆碱酯酶的性能。使用电泳方法分离，证实这种大分子的酶是乙酰胆碱酯酶的同工酶（isozyme）。它们的寿命仅有乙酰胆碱酯酶的一半，在家蝇的头部及胸部发现的同工酶对抑制剂的敏感性低于乙酰胆碱酯酶。

2．乙酰胆碱酯酶（简写AChE）水解乙酰胆碱的过程

可用下列反应式来说明。

上式中E代表酶，AX代表底物乙酰胆碱。从反应开始到酶恢复共分为三个步骤：

第一步形成酶底物复合体（E稟X），可以用解离常数Kd来表示复合体的形成，Kd=K-1/K＋1，Kd值愈小表明E和AX的亲和力愈强。

第二步是乙酰化的步骤，是化学反应，用速率常数K2来表示反应速率，复合体放出胆碱（X），酶与乙酰基结合形成乙酰化酶（EA）。

第三步是水解反应，乙酰化酶被水解为乙酸（A）与酶（E），由于反应后酶与酰基分离又称为脱酰基反应，以水解速率常数K3表示这步反应。

全部反应从开始到酶恢复需要2～3ms。在哺乳动物中以脱酰基K3步骤最慢，而家蝇头部的AChE水解乙酰胆碱时以乙酰化K2步骤最慢。

目前，对AChE组成蛋白质的氨基酸尚未研究清楚，仅知道在AChE上有与底物进行反应的酯动部位、结合部位和变构部位。

（1）酯动部位。又称催化部位，是AChE与乙酰胆碱反应的主要部位，是催化分解乙酰胆碱发生乙酰化，有机磷发生磷酰化在此部位进行。在这个部位酶的丝氨酸[HOCH2CH（NH2）COOH]上的羟基与乙酰胆碱的乙酰基产生反应。

胆碱酯酶的催化作用来自酶蛋白分子本身的结构，不需要任何特异性辅基或中间媒介物参与。由于酶蛋白分子的卷曲，有些原来离得很远的氨基酸基团被拉得靠近了，形成一个活性区。AChE活性中心由三个主要区域组成：①酯动部位：含丝氨酸、组氨酸，能与ACh的羰基碳原子结合；②阴离子部位：用以固定底物，从而决定其特异性。至少含一个羧基，可能来自谷氨酸，能以静电吸引ACh的季铵阳离子基团；③疏水性区域：催化底物水解过程。与酯解或季铵基团结合部位连接或在其附近，由色氨酸或酪氨酸等芳香族氨基酸组成，在与芳香基底物结合中起重要作用。

一般情况下，单独的丝氨酸并不能与碳酰基化合物产生反应。因此，认为AChE上的丝氨酸有特殊的性质。它受相邻的氨基酸——组氨酸的影响。组氨酸上的咪唑基团可以对丝氨酸上的羟基产生活化作用，诱导羟基与乙酰基产生反应。乙酰胆碱及各种抑制剂都是与AChE的酯动部位产生反应，但是，在反应之前酶必须先与抑制剂结合形成一个复合体。

（2）结合部位。在AChE上有结合部位。乙酰胆碱及各种抑制剂都是与AChE上的酯动部位产生反应，但是在反应之前，酶必须先与抑制剂结合形成一个复合体。早期研究认为，AChE上只有一个结合部位，称为阴离子部位。在阴离子部位，酶与乙酰胆碱的季铵基团—N＋（CH3）3结合。近代的研究认为，在酯动部位丝氨酸的四周有很多不同氨基酸的侧链基团，像一般蛋白质中的氨基酸一样，任何一个基团都有可能作为一个结合部位与底物或抑制剂相结合。根据Tripatri及O’Brien（1973）的研究，在一个抗性品系家蝇中得到一个突变型的AChE，它与乙酰胆碱结合非常正常，但是与有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂的亲和力减至原来的1/500。说明这个突变型的AChE与有机磷及氨基甲酸酯类化合物结合的部位，不是阴离子活动部位，必然还有其他的结合部位。现在知道在AChE上与抑制剂（杀虫剂）之间可能还有三个结合部位。

胆碱酯酶分子上的两个作用位点

除了阴离子部位，AChE与抑制剂之间可能还存在疏水基部位、电荷转移复合体（chargetransfercomplex，简称CTC）和吲哚苯基结合部位。

①疏水基部位：在这个部位，抑制剂的亲脂性基团如甲烷、乙烷及丙烷基团与酶结合，可以减小Kd值，增加亲和力。疏水基部已在丁酰胆碱酯酶中证实。在AChE上也可能有这个部位，已经发现N－甲基苯基氨基甲酸酯中，苯环上增加一个甲烷取代基对AChE的抑制能力增加3倍。

②电荷转移复合体：在酶与抑制剂结合时，如果一方是易失去电子的电子供体，而另一方是强亲电性的电子受体，则很容易结合。这种结合可以在吸收光谱中出现一个新的吸收峰。证明酶与抑制剂通过电荷的转移形成了复合体。在苯基氨基甲酸酯中，苯环上的取代基如果是吸电性基团则对AChE的活性抑制能力降低，如果是拒电性基团则对AChE的活性抑制能力增加，试验证实这种取代基主要是对AChE的亲和力产生影响，而对氨基甲酰化反应无影响。拒电性基团使亲和力增加（Kd值减小），认为是与酶的某一部位结合形成了电荷转移复合体。

③吲哚苯基结合部位：当AChE被一些试剂处理后，活性的变化很大。对乙酰胆碱失去了活性，对苯基乙酸酯和萘基乙酸酯也失去了活性。唯独对吲哚苯基乙酸酯的活性增加。说明AChE上有一个特殊的与吲哚苯基结合的部位。

（3）变构部位（allostericsite）。近年来在很多种酶上发现变构部位，因此，推测AChE也有变构部位。变构部位远离酶的活性部位。这个部位与某种离子或是某个化合物上的取代基团结合时，酶的蛋白质分子结构产生立体变型，使酶的活性受到影响，酶被活化或者是受到抑制。在AChE与各种化合物结合时，有的试剂使酶活性增加，有的使酶失去活性，可能是变构部位的影响。变构的影响在乙酶胆碱受体上已经证实。

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)是一种主要存在于人类和动物中枢神经系统的乙酰胆碱水解酶,其基本功能为催化水解神经递质-乙酰胆碱(Acetylcholine, ACh)导致神经冲动传递的终止,从而维持胆碱能神经的正常生理功能。医学上的神经系统疾病,例如老年痴呆症和帕金森病等多与人体内乙酰胆碱酯酶功能受到影响有关。 有机磷农药(Organophosphorus pesticides, OPs)与AChE结合会形成磷酰化ChE,磷酰化ChE很稳定,使酶失去催化水解ACh的能力并逐渐老化,造成ACh在体内的积累,最终导致胆碱能神经先兴奋后抑制。高含量的OPs可导致惊厥、呼吸困难、心律不齐、缺氧等急性中毒症状,低含量的OPs亦可经长期慢性毒害导致心脏、肝脏、肾和其他器官的损害。 乙酰胆碱酯酶生物传感技术具有灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂体系中进行在线连续监测等优点。近年来,乙酰胆碱酯酶生物传感器已成为有关AChE及相关物质检测研究最活跃的领域之一,建立新型的、有效的乙酰胆碱酯酶生物传感分析技术对于健康、食品、环境监测等仍然是一个热门而有意义的研究课题。本论文围绕开发易于操作、价格低廉和高灵敏信号转换的AChE生物传感方法开展了一些研究工作,主要内容如下： (1)基于尼罗红吸附纳米金的AChE荧光法检测有机磷。纳米金由于具有消光系数大、吸收光谱宽等优良的光学性质,常被用作为荧光共振能量转移(FRET)的受体,是一种理想的荧光淬灭剂。第2章中将荧光物质尼罗红非共价吸附在纳米金的表面,利用纳米金有效淬灭尼罗红的荧光,形成一个低背景的荧光信号。当存在AChE催化体系时,AChE催化底物硫代乙酰胆碱水解生成硫代胆碱,后者可与尼罗红竞争结合纳米金形成强的Au-S键,促使尼罗红从纳米金表面解吸附,并且产生一种比尼罗红荧光更强的新荧光产物,体系荧光大大增强。当存在有机磷时,AChE的活性被抑制,水解产物硫代胆碱减少,最终解吸附下的尼罗红产物——新荧光物质相应地减少。利用纳米金淬灭荧光的独特光学性质,成功构建了一种简单、易操作、高灵敏的AChE荧光检测方法。 (2)信号增强型的AChE荧光法高灵敏分析检测有机磷。信号增强型分析法是从低的背景信号开始,加入少量的待测物便能形成可检测信号,这使其具有更高的信噪比。