糖尿病患者因高血糖、炎症介质增加等因素，常罹患较严重的慢性牙周炎。近年来，Er ： YAG激光在牙周治疗中的应用逐渐普及，但对2型糖尿病相关性牙周炎老年患者的治疗效果如何还研究较少。菌斑微生物与牙周炎的发生密切相关已得到公认。目前认为，除了龈下菌群的量，其构成变化在牙周炎症过程中的作用也非常重要。本研究采用基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electropho-resis，DGGE）技术[1]分析2型糖尿病相关性牙周炎老年患者在激光治疗前后龈下菌群结构的动态变化，并进一步分析其优势菌群，为2型糖尿病患者龈下微生物的研究提供依据。1 材料和方法
1.1 病例选择
于2011年7—11月在四川大学华西口腔医院和华西医院内分泌科门诊就诊的汉族2型糖尿病老年患者中选择研究对象。经牙周检查，选取2型糖尿病同时伴中重度牙周炎者11例，其中男性6例，女性5例，年龄55～82岁，平均年龄68.5岁。2型糖尿病诊断标准[2]如下：空腹血糖浓度≥7.0 mmol·L-1，餐后2 h血糖浓度≥11.1 mmol·L-1，病史1～10年。本试验选择空腹血糖浓度≤8.0 mmol·L-1，即血糖控制尚可者。中重度慢性牙周炎根据Armitage的诊断标准[3]进行诊断。中度牙周炎：平均临床附着丧失（clinical attach-ment loss，CAL）为1.6～2.4 mm；邻面CAL≥3 mm的位点数≤8，且分布于至少3个象限或至少6颗牙；失牙数≤5。重度牙周炎：平均CAL≥2.5 mm；至少3个象限有1个或多个邻面位点CAL≥5 mm，且3个象限均有1个位点邻面CAL≥5 mm；失牙数≤14；每个象限至少有1颗牙的牙周袋探诊深度（probing depth，PD）>4 mm，且探诊出血（bleeding on pro-bing，BOP）阳性，X线检查示牙槽骨吸收大于或等于1/3。纳入标准：符合上述2型糖尿病和中重度慢性牙周炎诊断标准；所有患者半年内未做过牙周治疗；1个月内未服用过抗生素；糖尿病病情控制近期无明显变化，用药情况比较稳定；饮食及运动习惯无改变；无糖尿病其他严重并发症；无全身其他的严重疾病及感染。排除标准：患有糖尿病其他严重并发症；伴发其他系统性疾病或炎症性疾病；近期服用过免疫抑制剂、抗生素，局部使用抗菌性漱口水等可能严重影响测量指标的药物；半年内做过相关牙周治疗。
患牙入组标准：从选取的糖尿病相关性牙周炎患者口内选择13对患牙（牙周状况相近的左右对称同颌同名牙；位点满足如下条件：4 mm 1.2 治疗过程
对参加此次研究的检查者进行Er ： YAG激光相关操作指导培训。本研究采用自身随机对照的单盲试验（对临床指标评价者设盲），并对检查者进行校正检验。所有检查、诊断及治疗均由同一名口腔医生完成。治疗时间为上午8至10时。试验组、对照组患牙均行临床检查并记录牙周指标数值，试验组经超声龈上洁治后，分别进行相应的龈下激光治疗和超声治疗；对照组患牙仅采样，不做治疗。24 h内完成全部治疗。术后第1、3个月收集同一位点的龈下菌斑。样本采集方法：取样患牙隔湿后，去除龈上菌斑并用气枪从根方向冠方吹干牙面，成品无菌纸尖轻轻插入牙周袋最底部吸取龈下菌斑，静置约20 s后，取出置于含l mL PBS缓冲液的EP管中，-80 ℃保存备检。
激光组治疗：采用激光治疗仪配置的2061手机，其工作导棒为矩形棱柱体。将连在手机头上的光纤棱柱体插入牙周袋，喷水下与根面呈15°～20°照射，缓慢向根尖方向移动，直到袋底位置；沿从龈缘到袋底若干平行路径，覆盖整个病变根面。当根面检测不到菌斑、牙石时，治疗自动中断。
治疗前对患者进行口腔卫生宣教，每次复查均要强化菌斑控制意识并贯穿全程。
1.3 龈下菌斑DNA提取及纯度测定
使用QIAam[第一论文网专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临www.dylw.net]pTM DNA micro Kit试剂盒（QIAGEN Sciences公司，美国）提取全基因组DNA。使用核酸定量仪NanoDrop 1000 Spectrophotometer（Thermo Scientific公司，德国）检测得到的细菌基因组 DNA的浓度和纯度。
1.4 PCR
使用通用引物Bac1（5’-CGC CCG CCG CGC C-CC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC GAC TAC GTC CCA GCA GCC-3’）和Bac2（5’-GGA C-TA CCA GGG TAT CTA ATC C-3’）对样本的16S rDNA基因进行扩增。琼脂糖凝胶电泳验证PCR扩增产物。
1.5 DGGE及条带分析
以8%的聚丙烯酰胺凝胶形成40%（含2.8 mol·L-1尿素及体积分数24%甲酰胺）至60%（含4.2 mol·L-1尿素及体积分数24%甲酰胺）的线性浓度梯度。使用Bio-Rad Dcode系统恒定60 V电压，58 ℃下电泳
17 h。电泳完成后，用Molecular Imager Gel Documen-tation system获取并记录DGGE凝胶的数码图像。为了验证试验的可重复性，重复跑胶2～3次。为便于不同胶板之间进行比对，本试验在DGGE胶板上设置Marker。
采用样品平均条带数反映样品种群多样性，同时分析菌属类型的变化，寻找特异性条带；对感兴趣的特异性DNA条带进行切胶，回收，测序。
2 结果
2.1 试验组患牙位点的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
本文选取激光组与超声组各13颗患牙治疗前以及治疗后第1、3个月同一位点的龈下菌斑，采用通用引物扩增龈下菌斑全细菌16S rDNA序列，行1.5%琼脂糖凝胶电泳，得到单一一致的条带，产物片段长度约为300 bp（图1）。通过DGGE检测PCR产物获得指纹图谱进行分析。
2.2 试验组和对照组患牙的龈下微生物图谱分析
DGGE电泳图谱显示两组样本均具有丰富的细菌多样性，且组间16S rDNA指纹图谱条带构成存在差异（图2）。选择两组中分布有较大差异的DNA条带（见图2中的1、2）进行切胶并回收测序，测序结果分别与中间普雷沃菌（Prevotella intermedia）克隆NCAR1112、福赛斯坦纳菌（Tannerella forsythia）克隆WI040相似性最高。
2.2.1 条带均数的比较 试验组患牙的平均条带数为16.7±0.92，对照组为19.3±1.18，试验组条带均数较对照组减[第一论文网专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临www.dylw.net]少，其差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2.2 差异条带种类分析 分析DGGE图谱，共发现25种不同的条带，其中7种在约85%的样本
中均有出现，5种在100%的样本中出现。对试验组与对照组中条带分布差异较大的1、2条带行切胶测序，其结果见图3。由图3可见，条带种类17、14（分别对应图2的条带1、2）在组间分布有较大差异。
2.3 试验组患牙两种治疗方法治疗后的图谱分析
激光组和超声组治疗后1、3个月的龈下菌斑全细菌DNA水平DGGE图谱见图4。激光组治疗后1、3个月与治疗前条带数的差值分别为5.15±0.89、1.69±0.85，超声组则分别为5.38±1.12、-0.84±0.68。组间比较：治疗后1个月，激光组与超声组条带数差值的差异无统计学意义（P>0.05）；治疗后3个月，激光组条带数差值明显高于超声组（P<0.05）。组内两两比较：激光组治疗后1个月条带数与治疗前相比明显增加（P<0.05）；治疗后3个月，与治疗前的差异无统计学意义（P>0.05），与治疗后1个月相比则明显减少（P<0.05）。超声组内两两比较的结果与激光组类似。
2.4 激光治疗前后患牙龈下菌群的动态变化
结合条带差值分析结果可以看出，激光组样本条带均数在治疗后第1、3个月均较治疗前增加，1个月时增加最明显，1个月时条带均数与治疗前、治疗后3个月比较差异均有统计学意义（P<0.05）。选择治疗后减弱、消失的2个DNA条带（图5中的3、4）和治疗后新出现的1个DNA条带（图5中的5）切胶并回收测序，分析条带差异的种类。
条带种类分析结果见图6，共发现31种不同条带（条带1～31），其中3种在约100%样品中出现。条带种类2和15（分别对应图5中条带4和3）为治疗后减弱、消失的条带，条带种类22（对应图5中条带5）为治疗后新出现条带。从DGGE图谱及条带类型变化图可以看出，治疗后1个月图谱变化明显，出现新的条带（图5中条带5），菌群组成发生了变化。条带5测序结果与放线菌的一种（Actinomyces sp. oral strain Hal-1065）相似性最高。治疗后3个月的图谱与治疗前相比变化不明显。治疗后明显减弱、消失的3、4号条带，切胶测序结果与福赛斯坦纳菌（Ta-nnerella forsythia） 克隆WI040相似性最高。
3 讨论
研究[4]发现，疾病状态下环境微生物群落的多样性会发生改变，往往表现为比健康状态下的多样性减少。伴2型糖尿病的慢性牙周炎患者因长期高血糖的作用，其龈沟液中化学组分以及牙周组织的结构等均有较大改变，龈下菌斑微生物的种类、构成均会受到影响；但与不伴全身疾病的慢性牙周炎比较，其构成变化及相关优势菌群的变化仍有争议[5]。本试验DGGE图谱分析表明，与对照组相比，试验组龈下菌斑的细菌多样性明显减少，可能是由于糖尿病导致口腔局部环境改变，如口腔唾液分泌减缓，唾液成分的组成及含量发生改变所致。这些环境的改变可能导致口腔生态平衡的破坏，一部分细菌被抑制，这些细菌减少、消失甚至被替代。这提示糖尿病疾病状态可能参与了细菌群落多样性的改变。该结果也支持牙周炎的发生发展是由于口腔菌群平衡失调，并非某一种或几种特异性致病菌或整个口腔微生物数量增多所致的假说[6]。
Collin等[7]在研究老年糖尿病相关性牙周炎患者龈下菌群的特点时发现：牙龈卟啉单胞菌、伴放线菌嗜血菌、福赛斯坦纳菌在糖尿病组中检出率较高，与不伴糖尿病的牙周炎患者相比在统计学上有差异。马丽[5]研究显示，糖尿病相关性牙周炎组伴放线菌嗜血菌、福赛斯坦纳菌的检出率及相对含量显著高于不伴全身疾病的慢性[第一论文网专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临www.dylw.net]牙周炎组，提示二者龈下菌群的种类和细菌数量有差别。本试验条带种类分析结果显示，糖尿病相关性牙周炎与不伴全身疾病的慢性牙周炎患者之间有较大差别的菌种，分别为福赛斯坦纳菌和中间普雷沃菌。近年来，中间普雷沃菌已成为一种公认的与慢性牙周炎发生发展密切相关的可疑致病菌，在慢性牙周炎患者的龈下菌斑中属优势菌。本试验结果显示，该菌在糖尿病相关性牙周炎者的分布未见明显优势，此结果与马丽[5]的研究相同。福赛斯坦纳菌是目前牙周炎三大证据最为充分的致病菌之一[8]，与牙周附着丧失、牙周袋深度增加及牙槽骨吸收密切相关，而通过传统的洁刮治方法难以清除该菌。研究[5]发现，福赛斯坦纳菌含量与空腹血糖水平呈正相关，在牙周炎与糖尿病的相互作用中可能发挥重要作用。本试验测序结果亦支持此观点。综上所述，牙周可疑致病菌在糖尿病相关性牙周炎患者和单纯牙周炎患者的分布具有差异。究其原因，可能在于2型糖尿病引起全身及牙周状况改变后，更利于福赛斯坦纳菌的定植，大量繁殖后成为优势菌；而其他龈下致病菌比如中间普雷沃菌因不能适应机体环境的改变，最终导致龈下菌群的构成发生改变。
Er ： YAG激光是目前牙周治疗中常用的一种激光，具有良好的热机械消融性和高水吸收性，去除牙石时，因其能量能完全被根面硬组织表层的水所吸收，几乎不会对牙周组织和牙骨质造成热损伤，同时具有可靠的抑菌、杀菌作用[9]。分析激光治疗糖尿病相关性牙周炎患者前后的菌群动态变化图谱，可以发现龈下菌群中细菌种类和多样性在治疗前后发生改变。龈下菌群总的条带数增加，尤其是治疗后1个月时有新条带出现，提示重新分布的菌群组成与治疗前存在差异，龈下菌斑微生物多样性增加。本试验的结果与张冬梅等[10]的报道一致。Er ： YAG激光治疗作为一种外界干预打破了原有菌群之间的平衡，不同种属的细菌对激光治疗具有不同的敏感性，原来的优势菌福赛斯坦纳菌减少，非优势菌放线菌开始活跃，逐渐成为新的优势菌，达到新的平衡。Greenstein[11]发现，牙周愈合主要发生在治疗后1个月。由此推测，此时菌群的构成多样性与健康牙周状态更为接近，治疗后1个月为治疗的关键时期，此时可以增加干预防治措施。对治疗后1个月时出现的特异性条带测序，结果显示为放线菌属，这提示1个月后优先定居的放线菌属比其他牙周可疑致病菌更占优势。Socransky等[12]认为，牙周治疗后龈下菌斑中新出现的细菌可能是链球菌属或放线菌属，本试验结果与之相符。
治疗后3个月，龈下菌群DNA条带均数呈下降趋势，但超声组条带均数的下降明显多于激光组。超声组多样性减少的原因，可能是由于在糖尿病疾病状态下，牙周微环境更利于致病菌繁殖，随时间推移，牙周可疑致病菌[第一论文网专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临www.dylw.net]重新
定植成为优势菌，其他细菌生长受抑制，致使细菌多样性减少，逐渐恢复到与治疗前相近的菌群结构；这提示牙周可疑致病菌在超声治疗后3个月有再定植的趋势。激光组细菌多样性仍有一定的增加，可能要归因于其良好的抗菌性。已有研究[13]表明，带有自动荧光反馈系统的激光仪照射后的根面可获得较光滑均一的表面，降低炎症因子的水平，从而延缓细菌再定植的进程。从这一角度分析，激光在延缓细菌早期定植、控制疗效方面具有一定优势。Liu等[14]的研究表明，慢性牙周炎经基础治疗后42 d即有大量细菌的再定植，且细菌的定植不伴随临床症状的反复，提示临床症状的改善与微生物变化存在不一致性。本试验亦得出类似结果，治疗后3个月时龈下致病菌的再定植早于临床指标的回复。究其原因，可能是治疗措施改变了牙周袋的理化环境，导致试验对象易患性降低所致；但其原因和机制，有待进一步研究。
治疗后3个月时龈下致病菌出现再定植，可见有效、持久的菌斑控制至关重要。维护期口腔卫生往往决定着牙周系统治疗的成败，这一阶段应增加复查、复治次数，强化口腔卫生指导，待龈下菌群稳定后逐步延长治疗间隔时间。
本研究探讨了Er ： YAG激光治疗对2型糖尿病相关性牙周炎老年患者龈下菌群的影响，发现其菌群种类和比例发生改变，治疗后1个月细菌多样性增加，3个月Er ： YAG激光在延缓细菌再定植方面可能具有优势。本试验尚缺乏长期纵向研究，治疗后牙周状态稳定时的龈下菌群分布还需进一步研究。
[参考文献]
[1] Li Y， Saxena D， Barnes VM， et al. Polymerase chain reaction-based denaturing gradient gel electrophoresis in the evalua-tion of oral microbiota[J]. Oral Microbiol Immunol， 2006， 21（5）：333-339.
[2] 叶任高， 陆再英. 内科学[M]. 6版. 北京： 人民卫生出版社， 2004：797-798.
[3] Armitage GC， Wu Y， Wang HY， et al. Low prevalence of a periodontitis-associated interleukin-1 composite genotype in individuals of Chinese heritage[J]. J Periodontol， 2000， 71（2）：164-171.
本文选自《华西口腔医学杂志》2014年第2期，版权归原作者和期刊所有。
