TLR4是一种重要的模式识别受体，参与了机体针对多种病原体的天然免疫。早期研究认为TLR4主要是识别革兰阴性菌胞壁内毒素的主要成份脂多糖（LPS），随着研究的深入，人们发现TLR4还可以识别病毒蛋白，参与抗病毒免疫应答[1]。目前的研究已经显示，TLR4与HCV及HBV相互作用，促进病毒的复制与扩散，引起组织炎症，继而增加罹患肝纤维化/肝硬化的风险[2-7]。鼠肝炎病毒（MHV）是一种广泛存在的冠状病毒，可以在小鼠中引起病毒性肝炎，目前尚无研究报道MHV-3病毒蛋白可以与TLR4相互作用。本实验室采用3型鼠肝炎病毒（MHV-3）腹腔注射C3H/HeJ小鼠建立了肝炎病毒持续感染的模型[8]。C3H/HeJ小鼠的TLR4基因存在自发性突变，导致该小鼠TLR4缺陷而对LPS无反应[9-11]，但该小鼠其他遗传背景均与TLR4正常表达的C3H/HeN小鼠相同。本研究采
表1 小鼠感染MHV-3后临床症状评分
评分 皮毛质地 呼吸 身体颤抖
5 光泽柔顺 约200次/min 正常，无颤抖
4 无光泽，较柔顺 约230次/min 身体略有颤抖
3 无光泽，竖毛 230~260次/min 较明显颤抖，拱背，静止懒动
2 竖毛，粘连 超过260次/min 较明显颤抖，拱背，爬行缓慢
1 竖毛，粘连，潮湿 超过260次/min，伴有胸腹部舒缩 明显颤抖，拱背，基本不能行动
用C3H/HeJ及C3H/HeN两种亚系小鼠建立病毒性肝炎模型，观察并比较两种亚系小鼠的临床症状及存活情况，探讨TLR4对MHV-3诱导的C3H/He小鼠病毒性肝炎的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
6~7周龄雌性C3H/HeJ 40只，购自北京华阜康动物生物科技股份有限公司，许可证号SCXK京2009-0004，6~7周龄雌性C3H/HeN 40只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK京2012-0001。所有小鼠饲养于IVC系统。在12/12h昼夜循环、恒温恒湿条件下自由摄取食水，饲养1周后开始试验。
1.2 病毒株
MHV-3为本研究室保存病毒株，在DBT细胞系空斑纯化后于鼠17CL1细胞系繁殖培养，鼠L2细胞系蚀斑纯化和滴度测定。本研究所用MHV-3滴度为1.0×106 PFU/mL。
1.3 动物模型的建立
随机取C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠各30只，腹腔注射 100μL MHV-3（0.1 PFU/μL），另取C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠各10只，注射100μL 无菌PBS作为对照。注射后的小鼠，继续饲养于IVC系统。在12/12h昼夜循环、恒温恒湿条件下自由摄取食水。
1.4 小鼠生存状态观察
每天观察小鼠生理状况及死亡情况，并对每只存活小鼠皮毛、呼吸及身体颤抖三项特征进行评分[12]。正常状态记为5分，状态明显异常记为1分，综合评分满分为15分，见表1。计算每组存活小鼠的平均得分，已死亡小鼠不参与计分。两组小鼠均观察至感染后40d。
1.5 统计学分析
应用Sigma Plot12.0统计软件包进行资料分析，临床症状评分采用重复测量数据的方差分析进行比较，生存率的比较采用Kaplan-Meier生存分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况
C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠均于感染后3d开始一般状态变差，精神萎靡，毛发无光泽，感染2周内，小鼠症状明显，可见毛发竖直粘连，呼吸加快，颤抖拱背，肢体无力，行动迟缓，并出现死亡，临床症状综合评分均出现明显下降，感染2周后临床症状开始缓解，小鼠状态均明显好转，感染3周后，存活小鼠状态基本恢复，综合评分接近正常水平，见图1。注射PBS的对照小鼠，均未出现临床症状。
采用重复测量数据的方差分析进行统计，小鼠品系因素对临床症状评分不起作用，临床评分有随时间变化的趋势，且时间因素的作用随小鼠品系而不同，见表2。C3H/HeJ小鼠在感染后第4天，临床症状评分为（13.267±2.791），较正常水平显著下降（P=0.014）；感染后第25天，临床症状综合评分（14.500±0.535），与正常水平无差异（P=0.077）。而C3H/HeN小鼠在感染后第5天，临床症状评分为（10.933±4.608），较正常水平显著下降 （P＜0.001）；感染后第22天，临床症状综合评分（14.429±0.535），与正常水平无差异（P=0.076）。在感染后第5、6、13天，C3H/HeJ小鼠综合评分依次为（13.071±1.184）、（8.321±5.048）、（13.091±1.578），C3H/HeN小鼠综合评分依次为（10.933±4.608）、（11.304±3.901）、（10.846±3.671），两亚系小鼠综合评分有统计学差异（P＜0.001，P＜0.001，P=0.015），其他时间点两亚系小鼠综合评分无显著差异。
图1 MHV-3 感染后C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠临床症状综合评分
图中数据为各时间点存活小鼠皮毛、呼吸及身体颤抖三项指标综合评分的平均值。
表2 小鼠个体变异计算结果
Source of Variation DF SS MS F P
Sub-strain 1 0.828 0.828 0.131 0.718
Days 39 2195.628 56.298 15.987 ＜0.001
Sub-strain x days 39 236.517 6.065 1.722 0.004
2.2 存活率及平均存活时间
C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠分别于感染第4、5天开始出现死亡；感染5~6d为死亡高峰，两组小鼠均有近一半的死亡出现在这一段时期；在感染后12~14d，两组感染小鼠再次出现比较集中的死亡；感染20d后，小鼠状态基本[第一论文 网(www. dylw.NET) 专业提供论文写作和写作论文的服务,欢迎光临]稳定，至感染后40d未再出现死亡。C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠存活率分别为26.7％和23.3％，平均存活时间（mean survival time， MST）分别为16.267d和16.433d，差异无统计学意义（P=0.922）。死亡情况及生存率曲线分别见表3及图2。注射PBS的对照小鼠，均未出现死亡。
表3 C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠感染MHV-3后死亡情况
感染后
天数 死亡数量（只） 存活概率（％）
C3H/HeJ C3H/HeN C3H/HeJ C3H/HeN
Day 4 2 － 93.9 －
Day 5 － 7 － 76.6
Day 6 13 4 50.0 63.3
Day 8 2 － 43.3 －
Day 9 － 1 － 60.0
Day 10 － 1 － 56.7
Day 11 － 1 － 53.3
Day 12 2 3 36.7 43.4
Day 13 － 2 － 36.7
Day 14 3 3 26.7 26.7
Day 20 － 1 － 23.3
图2 MHV-3 感染后C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠生存曲线图
3 讨论
TLR4广泛分布于免疫细胞及组织细胞表面，并能利用四种转接分子MyD88（myeloid differentiation primary response protein 88）、MAL（MyD88 adaptor like protein，MAL）、TIRAP（TIR associated protein，TIRAP）、TRIF （TIR domain containing adaptor protein inducing IFN-β）和TRAM（TRIF related adaptor molecule）传递信号级联反应，激活NF-КB、AP-1及IRF3等转录因子，诱导IFN-γ、IFN-β、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18、TNF-α等多种细胞因子的表达，具有多种生物学效应[13]。
近几年，TLR4在病毒性肝炎中的作用引起了人们的广泛兴趣。研究发现，HCV的非结构蛋白NS5A能特异性上调肝细胞和B细胞的TLR4的表达，增强细胞分泌IFN-β和IL-6的功能，诱导了抗病毒效应和炎症反应[2，14]。NS5A亦可与MyD88的死亡结构域结合，干扰髓样树突状细胞和巨噬细胞TLR4信号通路传导，抑制TLR4配体介导的细胞因子的产生，促进了HCV的持续感染[3-4，15]。而在HBV感染者中，Kupffer细胞TLR4下游TRIF信号通路激活，可以诱导干扰素的产生与分泌而抑制病毒复制[16-17]。但患者PBMC中TLR4的表达往往是下降的[6]，这可能是引起HBV持续复制的机制之一。
本实验室建立的MHV-3诱导的肝炎病毒持续感染C3H/He小鼠模型，在6~15d内出现急性肝炎的表现，并引起死亡，存活小鼠转为持续感染，对其急性肝炎向慢性化衍变期的免疫状态及病毒复制情况进行研究，是探讨病毒性肝炎慢性迁延的免疫机制的有力工具[8]。本研究中，TLR4缺陷的C3H/HeJ小鼠和TLR4正常的C3H/HeN小鼠在感染MHV-3后，临床症状变化时间基本一致：分别于感染后第4、5天出现临床症状综合评分显著下降，并分别于感染后第25、22天恢复至正常水平。两亚系小鼠出现集中死亡的时间点略有差异，C3H/HeJ小鼠在感染后第5天，而C3H/HeN小鼠在感染后第6天。死亡时间点的差异，导致了在感染后第5、6、13天，两亚系小鼠临床评分的差异。但两亚系小鼠死亡时间点非常接近，小鼠存活率及平均存活时间并未出现统计学差异。本研究结果提示，TLR4并不会影响MHV-3诱导的C3H/He小鼠病毒性肝炎的转归。这[第一论文 网(www. dylw.NET) 专业提供论文写作和写作论文的服务,欢迎光临]与早期的研究结论一致，不同小鼠品系对MHV病毒的敏感性主要与MHV受体相关[18]，同时也提示TLR4在MHV-3感染引起的宿主免疫应答中可能并不发挥主要作用。
虽然临床症状和一定的死亡率是MHV-3诱导的肝炎病毒持续感染C3H/He小鼠模型的重要特征，但这仅是MHV-3感染后引起的病理生理改变的一个方面。还需要进一步的研究，来比较两种亚系小鼠感染后细胞因子谱、肝脏病理、血清生化学指标以及肝内病毒复制水平等多个方面的改变，甚至与其他多种C3H/He亚系小鼠或基因敲除小鼠进行比较，才能明确TLR4是否在MHV-3感染引起的宿主免疫应答中发挥作用[7]。
本研究作为MHV-3诱导的肝炎病毒持续感染C3H/He小鼠模型的补充，其意义并不仅仅在于探讨TLR4在MHV-3感染中的作用。随着生活水平的提高和生活模式的转变，我国病毒性肝炎合并酒精性肝病（alcoholic liver disease， ALD）或非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD）的发病率逐步上升。已有研究证实，TLR4参与了ALD和NAFLD，以及HCV感染合并ALD引起的肝脏损伤[5， 14， 19-20]。采用TLR4正常的C3H/HeN小鼠替代TLR4缺陷的C3H/HeJ小鼠建立MHV-3诱导的肝炎病毒持续感染模型，可以为建立病毒性肝炎合并ALD/NAFLD动物模型奠定基础，对进行病毒性肝炎合并ALD/NAFLD的免疫学机制研究具有重要意义。
[参考文献]
[1] Mogensen TH，Paludan SR.Reading the viral signature by Toll-like receptors and other pattern recognition receptors[J].J Mol Med（Berl），2005，83（3）：180-192.
[2] Machida K，Cheng KT，Sung VM，et al.Hepatitis C virus induces toll-like receptor 4 expression， leading to enhanced production of beta interferon and interleukin-6[J]. Journal of Virology，2006，80（2）：866-874.
[3] Miyazaki M，Kanto T，Inoue M，et al.Impaired cytokine response in myeloid dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection regardless of enhanced expression of Toll-like receptors and retinoic acid inducible gene-I[J].Journal of Medical Virology，2008，80（6）：980-988.
[4] Abe T，Kaname Y，Hamamoto I，et al.Hepatitis C virus nonstructural protein 5A modulates the toll-like receptor-MyD88-dependent signaling pathway in macrophage cell lines[J].Journal of Virology，2007，81（17）：8953-8966.
[5] Rivera CA，Adegboyega P，van Rooijen N，et al.Toll-like receptor-4 signaling and Kupffer cells play pivotal roles in the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis[J].Journal of Hepatology，2007，47（4）：571-579.
[6] Chen Z，Cheng Y，Xu Y，et al.Expression profiles and function of Toll-like receptors 2 and 4 in peripheral blood mononuclear cells of chronic hepatitis B patients[J].Clin Immunol，2008，128（3）：400-408.
[7] Kamath AB，Alt J，Debbabi H，et al.Toll-like receptor 4-defective C3H/HeJ mice are not more susceptible than other C3H substrains to infection with Mycobacterium tuberculosis[J].Infection and Immunity，2003，71（7）：4112-4118.
[8] 覃小敏，张江国，苏凯，等.慢性病毒性肝炎小鼠动物模型的建立及其特征分析[J].Virologica Sinica，2006，21（5）：417-420.
[9] O'Brien AD，Rosenstreich DL，Taylor BA.Control of natural resistance to Salmonella typhimurium and Leishmania donovani in mice by closely linked but distinct genetic loci[J].Nature，1980，287（5781）：440-442.
[10] Poltorak A，He X，Smirnova I，et al.Defect
ive LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice： mutations in Tlr4 gene[J].Science，1998，282（5396）：2085-2088.
[11] Nowicki B，Singhal J，Fang L，et al.Inverse relationship between severity of experimental pyelonephritis and nitric oxide production in C3H/HeJ mice[J].Infection and Immunity，1999，67（5）：2421-2427.
[12] Wu ZG，Yan WM，Guo W，et al.Telbivudine preserves T-helper 1 cytokine production and downregulates programmed death ligand 1 in a mouse model of viral hepatitis[J].Journal of Viral Hepatitis，2010，17 (Suppl 1)：24-33.
[13] Akira S，Takeda K. Toll-like receptor signalling[J]. Nature reviews Immunology，2004，4（7）：499-511.
