[摘要] 目的 测定槲皮素、根皮苷、杨梅素、原花青素、葛根素和柚皮苷对超氧阴离子自由基（O-2·）的清除能力，探讨6种化合物清除O-2·的构效关系。 方法 采用流动注射邻苯三酚-鲁米诺化学发光法测定6种化合物对O-2·的清除率，采用IC50来衡量样品对自由基的清除能力。以维生素C为阳性对照。 结果 槲皮素、根皮苷、杨梅素、柚皮苷、葛根素、原花青素对O-2·的抑制率分别为0.1547、0.2048、0.4623、0.6157、1.8098、2.9798 μmol/L。6种化合物清除O-2·能力从大到小依次为槲皮素、根皮苷、杨梅素、柚皮苷、葛根素、原花青素，均高于维生素C（4.9586 μmol/L）。 结论 6种黄酮类化合物结构与清除O-2·能力密切相关：酚羟基是其清除O-2·的必要基团，B环的羟基化程度、羟基的数目和位置，C环开环后形成的羟基和双键，A环取代基的位置、数目以及化合物的空间结构，均是影响抗氧化活性的重要因素。
[关键词] 6种黄酮类化合物；超氧阴离子自由基；清除率；构效关系
[中图分类号] O657.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）10（b）-0007-05
Study of 6 flavonoids compounds for the scavenging superoxide anion free radical ability and the structure-activity relationships
ZHAO Jing1 LI Yuqin2▲ WANG Fangqiao2 JIA Baoxiu2 LIU Caihong2 WANG Renliang3
1.Taishan Sanatorium of Shandong Province， Shandong Province， Tai'an 271000， China； 2.School of Pharmacy， Taishan Medical University， Shandong Province， Tai'an 271016， China； 3.School of Chemical Engineering， Taishan Medical University， Shandong Province， Tai'an 271016， China
[Abstract] Objective To study the scavenging superoxide anion free radical （O-2·） ability of quercetin， myricetin， phloridzin， naringin， puerarin and proanthocyanidins， and to explore their structure-activity relationships for removing O-2·. Methods The scavenging O-2· ability was determined by flow injection analysis-pyrogallol-chemiluminescence. IC50 was calculated and used to examine the scavenging free radical ability. Vitamin C was used as positive control. Results The results showed that IC50 of quercetin， myricetin， phloridzin， naringin， puerarin and proanthocyanidins were 0.1547， 0.2048， 0.4623， 0.6157， 1.8098， 2.9798 μmol/L， respectively. The scavenging O-2· ability of the 6 compounds were arranged as quercetin， myricetin， phloridzin， naringin， puerarin and proanthocyanidins， and all were higher than Vitamin C （4.9586 μmol/L）. Conclusion The scavenging O-2· ability of 6 flavonoids compounds have been closely related to their structures： phenolic hydroxyl is the necessary group for removing the O-2·， the degree of hydroxylation， the number and location of hydroxyl of B ring， the hydroxyl and double bond of the formatting of C ring opening， substituent position， number and spatial structure of A ring， are all important influencing factors of antioxidant activity.
[Key words] Six flavonoids compounds； Superoxide anion free radical； The scavenging ability； The Structure-activity relationships
生物体在自身的新陈代谢过程中会产生大量的活性氧自由基，超氧阴离子自由基（O-2·）是具有代表性的活性氧自由基之一。研究表明，许多疾病，如癌症、循环系统疾病、代谢失调、光损伤、毒物侵害等都与人体内的自由基有关。O-2·的破坏作用是通过一系列链式反应实现的，可引发组织的不断氧化消耗，其结果是破坏性和不可逆转的，只能通过加入抗氧化剂终止链反应。因此，寻找能够清除活性氧自由基的抗氧化剂具有十分重要的意义。
众多研究表明，天然黄酮类化合物有抗突变、抗肿瘤、抗炎、治疗心血管疾病等广泛生物学活性，其中最为重要的是它能减少自由基的形成和清除自由基[1-5]。然而黄酮类化合物种类繁多，其清除自由基的功效与每种化合物的具体结构有关，因而不同的物质可能对不同体系的抗氧化作用不同，对不同类型的自由基和组织也存在选择性作用[6-10]。了解黄酮类化合物抗氧化、清除自由基的构效关系，对于通过化学修饰的方法有效改变黄酮类化合物现有结构弱点，增强其生物学活性，增大其实用价值有重要意义。
笔者通过体外实验研究槲皮素、根皮苷、杨梅素、原花青素、葛根素和柚皮苷6种黄酮化合物对O-2·的清除能力，探讨6种化合物抗氧化作用的构效关系。
1 仪器与试药
MPI-B型多功能化学发光检测器（西安瑞迈分析仪器有限公司），自动电位滴定仪ZD-2型。槲皮素、根皮苷、杨梅素、原花青素、葛根素、柚皮苷和维生素C对照品购自中国药品生物制品检定所；邻苯三酚、无水碳酸钠、碳酸氢钠（天津市博迪化工有限公司）；鲁米诺（上海蓝季科技发展有限公司）。
2 方法与结果
2.1 溶液配制
鲁米诺储备液（1.0×10-2 mol/L）：称取适量鲁米诺，用0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，并定容至50 mL棕色容量瓶，冰箱中储存。
维生素C溶液（1.0×10-2 mol/L）：称取适量维生素C用水溶解，并定容至100 mL容量瓶中。
槲皮素、根皮苷、杨梅素、原花青素、葛根素、柚皮苷储备液（1.0×10-2 μg/mL）：用50%乙醇配制。
邻苯三酚（0.01 mol/L）：用0.01 mol/L HCl配成储备液，使用前用水稀释。
Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液（0.01 mol/L）：临用前新鲜配制。
2.2 流动注射化学发光法
实验管路见图1。蠕动泵分别泵入邻苯三酚溶液S、鲁米诺-碳酸盐缓冲液C和空白或被测物R，在反应器中混合并反应，产生发光信号。
P：蠕动泵；V：换向阀；F：检测器；W：废液；PTM：光电倍增管；HV：负高压；PC
：记录仪
图1 流动注射化学发光仪示意图
2.3 流动注射化学发光法实验程序编写
为了使体系发光稳定且发光较强，将增益设为3，高压为600 V。为了减少泵管的损耗，将主泵速度设为30 r/min，副泵速度设为30 r/min。试验程序见表1。
表1 超氧阴离子自由基试验程序
注：L：左，R：右；Y：是；F：向前
2.4 O-2·检测体系的优化
邻苯三酚在碱性条件下自氧化产生O-2·，O-2·与鲁米诺发生氧化反应，产生一个电子激发态的中间物，当其返回基态时，可产生化学发光现象，反应体系中O-2·的量可以间接地用化学发光强度I来表示[11]。以发光的稳定性、重现性以及强度为依据分别考察缓冲液pH、邻苯三酚和鲁米诺浓度对发光强度的影响。当缓冲液pH=10，邻苯三酚和鲁米诺浓度分别为0.005、0.06 mmol/L时，体系的稳定性、重现性以及发光强度最佳。见图2。
2.5 抗氧化测定及抑制率计算
在最佳条件下，分别测定空白溶液的发光强度（I0）和一系列加入样品溶液后体系的发光强度（IT）。根据发光信号的降低值（I0-IT），可定量分析6种化合物与维生素C清除O-2·的能力，可计算出加入不同浓度溶液后抑制发光的程度，即对自由基的抑制率：
抑制率=（I0-IT）/I0×100%
以发光抑制率为纵坐标，样品液浓度为横坐标，绘出发光抑制率曲线，并计算出发光抑制率为50%时的浓度IC50，用来衡量样品对自由基的清除能力。IC50值越小，表明样品清除自由基能力越强。每个样品平行测定6次。
2.6 6种化合物对O-2·的清除能力
测定不同浓度槲皮素、根皮苷、杨梅素、原花青素、葛根素、柚皮苷和维生素C溶液对发光强度的影响，O-2·的清除率，计算发光抑制率，并绘制发光抑制率曲线。见图3。
1.槲皮素；2.根皮苷；3.杨梅素；4.柚皮苷；5.葛根素；6.原花青素；7.维生素C
图3 6种化合物和维生素C对O-2·的清除作用
由图3可知，6种黄酮类化合物和维生素C溶液对O-2·的清除效果均呈现出剂量依赖关系，即随着溶液浓度的增大，其对O-2·的清除效果也增强。槲皮素、根皮苷、杨梅素、柚皮苷、葛根素、原花青素 6种化合物和维生素C溶液对O-2·的清除率IC50值分别为0.1547、0.2048、0.4623、0.6157、1.8098、2.9798、4.9586 μmol/L。提示对O-2·的清除能力大小依次为槲皮素、根皮苷、杨梅素、柚皮苷、葛根素、原花青素、维生素C。
3 讨论
3.1 黄酮类化合物结构
黄酮类化合物是以2-苯基色原酮为母核的一类物质，两个芳环（A、B环）之间以一个三碳链相连，具有C6-C3-C6基本构型，将三个环分别标为A、B、C（图4）。其母核上带有羟基、甲氧基、羟氧基等取代基分别形成各种黄酮类化合物，以游离苷原或以与糖结合的苷类等形式存在于许多植物中。黄酮类各环上的羟基活性相差较大：B环的酚羟基活性最高；当C环上羟基和不饱和双键相连时，C环也具有较强的抗氧化活性，A环的酚羟基活性最弱。
3.2 B环与抗氧化性
B环上的羟基化程度是抗氧化活性的一个主要因素，含邻位酚羟基黄酮类化合物与自由基反应形成了较为稳定的共轭半醌式自由基，从而中断游离自由基的链式反应，所以具有较强的抗氧化性。B环中的邻二酚羟基对黄酮类化合物的抗氧化活性起主要作用，具有强抗氧化活性的这类物质一般都有3′，4′-邻苯二酚结构。本实验中，槲皮素和杨梅素具有3′，4′-邻苯二酚结构，它们在6种化合物中抗氧化活性较强。羟基的位置和数目与抗氧化活也有密切的关系，羟基数目和位置的差异，使化合物表现出不同程度的抗氧化活性。本实验IC50值表明，槲皮素抗氧化活性远大于杨梅素，故可推测杨梅素B环5′位羟基抑制其抗氧化活性。
3.3 C环与抗氧化性
黄酮化合物C环的3位羟基是很重要的结构，3位上的羟基与2，3位间的双键可以发生异构化，变成二酮式，此结构在二位上产生具有较高活性的-CH-基团，不饱和C环延长了A、B环的共轭体系，使苯氧自由基更加稳定，增强了抗氧化活性。本实验中，槲皮素、杨梅素具有此结构，因此两者具有很强的抗氧化活性。通过比较根皮苷和柚皮苷的结构发现，根皮苷C环开环且两种化合物氧糖苷的位置不同。实验结果表明，根皮苷的抗氧化活性远大于柚皮苷，因此推测C环的开环结构和糖苷键的位置能够影响黄酮类化合物的抗氧化活性。一般认为，7位氧糖苷对活性不利，C环开环结构有助于增强化合物的抗氧化活性[12]。
3.4 A环与抗氧化性
天然黄酮类化合物A环的羟基大多处在C5和C7，不像B环那样，一般均具有邻二酚羟基。过去认为，A环不易被氧化，因而不直接参与抗氧化反应，但近来研究表明，A环也可发挥抗氧化作用[13]。同时，A环上的5，7位羟基有利于抗氧化活性，本实验中葛根素只有7位羟基，没有5位羟基，其抗氧化活性较弱。有实验表明，7位羟基在4′羟基存在时可以提高抗氧化活性[14]，本实验所研究的化合物均具有这种结构，IC50值表明它们的抗氧化活性均强于维生素C，故均具有很强的抗氧化活性。本实验表明，柚皮苷的抗氧化活性大于葛根素，因其A环上2′位多了一个多羟基环氧化物，故可推测A环上的取代基会影响黄酮类化合物的抗氧化活性[15-17]。
3.5 空间结构与抗氧化性
原花青素多以聚合物形式存在，本实验表明其抗氧化活性弱于其他5种黄酮类化合物，推测其空间结构影响了抗氧化活性。
本实验采用流动注射化学发光法测定6种黄酮类化合物清除O-2·的能力，此方法灵敏度高，快速测定，操作简单和重现性好，可用于评价物质的抗氧化活性及抗自由基活性药物的研究和筛选。研究结果表明，6种黄酮类化合物抗氧化活性与其结构密切相关，酚羟基是起抗氧化作用的必要基团，B环的羟基化程度、羟基的数目和位置，C环开环后形成的羟基和双键，A环取代基的位置数目以及化合物的空间结构，均是影响抗氧化活性的重要因素。
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