【摘要】 目的：分析肿瘤坏死因子α(tnfα)和γ干扰素(ifnγ)是否诱导体外培养角质形成细胞株hacat产生趋化因子rantes，了解柚皮苷是否影响tnfα和ifnγ对合成rantes的诱导作用。方法：tnfα和ifnγ刺激培养的hacat细胞，应用定量rtpcr方法测定rantes的mrna表达，应用elisa方法测定上清液中rantes。结果：正常培养hacat细胞rantes微弱表达, tnfα和ifnγ刺激使hacat细胞rantes的mrna表达与分泌量显著增加。柚皮苷0.5, 0.25 mmol·l1能抑制tnfα和ifnγ诱导的rantes分泌。结论：柚皮苷可抑制tnfα和ifnγ引起的hacat细胞分泌rantes。
【关键词】 柚皮苷；rantes；hacat细胞
趋化因子(chemokine)是一类诱导免疫细胞向特定的组织部位浸润和聚积的具有趋化和细胞活化作用的细胞因子。根据其成熟蛋白中保守半胱氨酸残基(c，cysteine)的排列，趋化因子可分为4种类型: cxc型、cc型、c型及cx3c型。受激活调节正常t细胞表达和分泌因子(regulated upon activation normal t cell expressed and secreted factor，rantes)属于cc家族成员。研究表明，rantes表达水平的升高与多种炎性疾病有关。WWw.133229.cOm如关节炎、特应性皮炎、银屑病、迟发性超敏反应、肾小球肾炎、哮喘、炎症性结肠炎等。rantes已经作为急慢性炎症的重要介质，其表达水平的升高是炎症反应的特征之一[1，2]。
黄酮类化合物具有显著的抗氧化作用、抗炎、抗内毒素作用，其抗氧化作用与细胞内某些还原酶如谷胱甘肽还原酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性增强有关[3]。而柚皮苷增强体内还原酶活性不足以解释其显著的抗炎、抗内毒素作用。为此，研究观察柚皮苷抑制人皮肤角质细胞rantes产生的作用。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂 柚皮苷(纯度99%, sigma 公司)、阿维a ；tnfα和infγ (美国peprotech asia)；dmem 培养基(gibco)；m tt(3 (4 ,5) 双甲基 2 噻唑 (2 ,5) 二苯基溴化四氮唑蓝，sigma 公司)；taq dna聚合酶（北京博大泰克biodev生物基因技术有限责任公司）；引物（上海生物工程有限公司）；人rantes定量elisa试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)；人表皮角质形成细胞hacat细胞株(本室保存)。
1.2mtt比色分析按照文献方法[4]，在96 孔培养板中加hacat 细胞悬液（1.5×104 个细胞/ 孔）培养过夜，依次加入含药的完全培养基，实验组分别加入不同浓度的柚皮苷，阳性对照药采用阿维a，药物浓度见表1，阴性照组用培养液替代药物，空白组仅加入不含细胞的培养液，每个浓度做3 个复孔。od 值测定波长为570 nm。结果按下式计算药物对细胞生长的抑制率:细胞生长抑制率% = (1 实验组od 值/对照组od 值)×100 %;以药物的不同浓度对角质细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线,从中求出药物的半数杀伤浓度ic50。
1.3 细胞培养上清液rantes含量测定 将hacat细胞接种于24孔板中（5×104/孔），加入含刺激因子（tnfα和/或infγ）的无血清 dmem培养基孵育24 h，同时进行实验组研究：不同浓度的柚皮苷以及阳性对照阿维a；每组各设3个复孔(见表2)。按照试剂盒内说明测定上清液中rantes的含量。
1.4rantes mrna 表达测定按上述方法培养并处理细胞，用trizol法提取细胞总rna，根据genbank／ncbi公布的rantes全长cdna序列，设计rantes引物。正义链为5′ccagcagtcgtcttt gtca 3′，反义链为5′atctccaaagagttgatgt 3′，扩增片段长度为96 bp。内参照hgapdh的引物正义链为5′cctcaagatcatcagcaat3′，反义链 5′ccatcca cagtcttctgggt3′，扩增片段长度141 bp。首先逆转录成cdna，在应用荧光定量pcr的方法测定rantes mrna的表达。反应条件为：94 ℃ 2min后进行下列循环，94 ℃20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s,80 ℃ 20 s共45个循环。 hgapdh复性温度为54 ℃。结果判定：判读ct值（扩增曲线进入指数期时的反应循环数），mrna相对定量根据公式计算：目的基因的相对量=2－△△ct，△△ct = [ct gi(待测样品)ct gapdh(待测样品)] [ct gi (校正样品) ct gapdh (校正样品)]。
2 结果
2.1mtt比色分析结果显示（tab.1）,表皮细胞株hacat细胞对阿维a反应敏感，对柚皮苷反应不敏感，各浓度组细胞增殖抑制几乎不受影响，细胞形态无明显变化。
tab. 1 柚皮苷对表皮细胞株hacat细胞增殖的影响（mtt法）
2.2rantes产生的作用
结果见tab.2，hacat细胞在用tnfα联合infγ刺激48小时后，上清液所含rantes的浓度明显增加，hacat细胞的形态产生了明显的变化，阿维a在 5×10-3 mmol·l-1，柚皮苷0.5、0.25 mmol·l-1预处理30min后可明显抑制rantes的产生。注：对照组相比 **p＜0.01 ***p＜0.0012.3rantes mrna的表达实时定量rtpcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳，rantes、gapdh的mrna基因转录扩增片段均在相应的分子量位置(fig. 1)。
根据实时荧光定量基因扩增的动力曲线，各组目的基因rantes以及内参gapdh的mrna相对量的比值见fig.2。正常培养hacat细胞及经tnfα+infγ、tnfα+infγ+阿维a、tnfα+infγ+柚皮苷处理细胞均有rantes、gapdh表达；rantes在细胞因子处理的细胞中显著表达，细胞因子未处理细胞微弱表达；而经阿维a、柚皮苷处理的细胞明显降低。fig.1rantes mrna经rtpcr表达产物的琼脂糖凝胶电泳图
3讨论
rantes由多种细胞分泌而来，作用于白细胞，使其趋化至炎症区域并将其活化[1，2]。曾有学者通过体外实验证实,正常人角质形成细胞受到适量的tnfα与ifnγ的联合刺激，其分泌至上清液中的rantes水平明显增高[5] 。本实验中，我们证实了联合使用tnfα与ifnγ能诱导人角质形成细胞rantes的明显增高。
柚皮苷全称为柚皮素7o新橙皮糖苷，属二氢黄酮类化合物，是橘红、骨碎补、枳实、枳壳等中药的主要有效成分[6]，具有显著的抗氧化作用、抗炎、抗内毒素作用。本实验中，通过elisa直接rantes的含量，证明了柚皮苷能抑制被tnfα与ifnγ诱导的hacat细胞的rantes的产生。同时分析了编码rantes基因的转录，应用荧光定量pcr技术，该技术为实时（realtime）荧光定量pcr，检测对象为反应进程中模板dna拷贝数的即时变化而非终产物含量。因而能够通过对ct值（扩增曲线进入指数期时的反应循环数）的准确判读，按指数扩增的规律计算出初始模板拷贝数。样本的ct值与该样本起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，ct值越小。同时mtt法测定柚皮苷在1mmol·l-1的情况下几乎不影响hacat细胞的活力，说明抑制rantes的诱导产生不是由于柚皮苷对细胞的潜在毒性而致。推测柚皮苷抑制rantes基因的转录以及表达可能通过一定的信号通路，有待进一步研究。
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