青钱柳提取物清除羟自由基和抑制脂质过氧化的作用
【关键词】 青钱柳;提取物;脂质过氧化;自由基
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【摘要】 目的 研究五种青钱柳提取物(cps)清除羟自由基和抑制脂质过氧化作用。方法 采用组织匀浆mda比色法测定不同浓度的cps对小鼠肝脏自发性脂质过氧化的作用。利用fenton 反应产生·oh，研究cps对羟自由基的清除作用，计算半清除率(ic50)。结果 五种提取物均明显的具有抗脂质过氧化作用，在浓度为1.0 mg·ml-1时，对小鼠肝组织自发性mda的抑制率大小为：正丁醇>石油醚>多糖>水>乙酸乙酯。cps对·oh自由基ic50大小为：水>石油醚>正丁醇>多糖>乙酸乙酯。结论 五种青钱柳提取物均有较强的体外抗氧化活性，且活性与浓度呈明显的量效关系。
【关键词】 青钱柳;提取物;脂质过氧化;自由基
free radical scavenging and antilipoperoxidant properties of
cyclocarya paliurus(bata1.) iljinskaya extracts
chen wei1，duan xiaoqun2，lu xi2，huang zhongshi3，liang chengqin2
(1.the affiliated hospital of guilin medical college,guilin 541001;
2.guilin medical college,guilin 541004;3.biochemistry department
of youjiang medical college for nationalities,baise 533000)
【abstract】 objective to study the effect of five kinds cyclocarya paliurus(bata1.) iljinskaya extracts(cps) on scavenging hydroxy radical and stopping lipid peroxidation.methods the effect of different density cps on mice liver spontaneous lipid peroxidation were detected by tissue homogenate mda chromatometry. invest the hydroxy radical scavenge effect of cps which produced by fenton reaction.then calculated the 50% inhibiting concentration(ic50).results the experiments showed that the five kinds extracts had obvious effects on antilipid peroxidation. at the concentration of 1.0mg.ml-1,it was found that the effect from strong to weak on mda generation spontaneously in liver of mice was nbutanol、petroleum ether,polysaccharide,water,ethyl acetate. the potency from strong to weak of scavenging free radicals ic50 was water,petroleum ether,nbutanol,polysaccharide,ethyl acetate.conclusion five kinds cyclocarya paliurus(bata1.) iljinskaya extracts have strong vitro function on antioxidant activity.there was obviously doseeffect relationship between activity and concentration.
【key words】 cyclocarya paliurus(batal.)iljinskaya;extracts; lipid peroxidation;free radical
青钱柳[cyclocarya paliurus(batal) iljinskaya](cps)又名青钱李(江西)，系双子叶植物纲(dicotyledoneae)胡桃科(juglandaceae)青钱柳属植物，它是我国独有珍稀树种资源[1]，分布于广西、江西、浙江等地的山区、溪谷或石灰岩山地，为广西特色植物。wWW.133229.cOm据《中国中药志要》记载，其树皮、树叶具有清热解毒，止痛功能，可用于治疗顽癣。长期以来民间用其叶片做茶，因其味甜有清热解暑、降糖、降压的功效，又称为甜茶，神茶等[2]。青钱柳干叶的主要成分有糖、氨基酸、有机酸、黄酮、酸性物质、内酯、香豆精、三萜及皂甙、甾醇等[2]。我国从1970年开始对青钱柳进行药用开发研究，发现青钱柳具有明显的降血糖、降血压、减肥、抗肿瘤、抗衰老、抗过敏、清热解暑、提高人体免疫力、促进新陈代谢等多种功效，尤其对治疗糖尿病有显著疗效[3]。本实验对青钱柳不同提取物的体外抗氧化性进行了研究，为更进一步开发青钱柳保健产品提供理论依据。
材料与方法
1.动物
昆明种小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，由桂林医学院实验动物中心提供。
2.实验材料与仪器
青钱柳采自广西阳朔县白沙镇青钱柳基地，752gw型紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)、fa2004电子天平(上海精科天平)、小型三用水箱(北京医疗设备厂)、xhb型旋涡混合器(江苏康健医疗用品有限公司)、ld0.8离心机(北京医用离心机厂)、旋转蒸发器(re52型，上海亚荣仪器厂生产)。
3.试剂
丙二醛(mda)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、蒸馏水、邻二氮菲、硫酸亚铁、过氧化氢均为分析纯，pbs液为自制。
4.实验方法
(1)青钱柳不同溶剂提取物的制备 取烘干过筛的青钱柳粉末，分别按固液比1∶20加入去离子水，用旋转蒸发器提取2 h，过滤，去残渣。滤液分两部分，一部分加入80%乙醇提取后再用水提取，利用水提醇沉淀法[4]用三氯醋酸去蛋白质后得到青钱柳多糖合物，另一部分加入80%乙醇，提取1.5 h，分别用正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取，得正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物，最后剩余的为水提物。各提取物均用真空浓缩至膏状，并于40℃真空干燥，冷藏备用。
(2)cps对小鼠肝脏自发性脂质过氧化的影响 小鼠禁食12 h后摘除眼球放血处死，取肝，在0～4℃下用生理盐水制成5%肝匀浆。实验分为对照组(10%肝匀浆)、阳性组(vitc)和高、中、低3个剂量的青钱柳提取物组(10%肝匀浆和青钱柳不同溶剂提取物配液)。以硫代巴比妥酸法测定mda含量，并计算抑制率：抑制率(ir)=(对照组mda-提取物组mda)/对照组mda。
(3)cps对羟自由基的清除作用 采用亚铁离子催化过氧化氢产生(·oh)的方法。在样品管中加0.75 mmol/l的邻二氮菲溶液1 ml，pbs 2 ml和1 ml样品，旋涡混合器混匀后，加0.75 mmol/l的硫酸亚铁溶液1 ml，旋涡混合器混匀后，加0.01%过氧化氢溶液1 ml，置恒温水浴中37℃保温1 h。反应液置比色皿中，于分光光度计中在536 nm测定吸光度as。用1 ml蒸馏水代替1 ml样品，测定吸光度为ap。吸光度为ab的管不加过氧化氢和样品，都以蒸馏水代替。按以下公式计算羟自由基的清除率(d%)：d%=(as-ap)/(ab-ap)×100。
5.统计学处理
计量资料以均数±标准差(-±s)表示，采用excel统计软件以t检验进行统计学处理，以p<0.05为有统计学意义。
结 果
1.cps对小鼠肝脏自发性脂质过氧化的影响 青钱柳各提取物对mda的生成均有抑制作用，随着各提取物浓度增加，部分提取物的抑制率也会相应增高。五种提取物中对mda抑制最强的为正丁醇提取物，在浓度为1.0 mg·ml-1时，对小鼠肝组织自发性mda的抑制率大小为：正丁醇>石油醚>多糖>水>乙酸乙酯。见表1。 表1 cps对小鼠肝脏自发性脂质过氧化的影响注：与正常对照组比： ※p<0.01
2.cps对羟自由基的清除作用 cps对·oh有清除作用，且作用较强。特别是正丁醇提取物、水提物和多糖合物，最高清除率可高达80%以上。随着各提取物浓度的增加，对·oh自由基的清除率不断增大。但到了一定浓度，再增加其浓度，反而清除率有所降低。半清除率(ic50)指清除率为50%时所需样品的浓度，根据不同浓度样品的清除率作曲线求出。所需浓度越低，表明半清除率越高，清除效果越好。通过计算所得ic50值，可比较各青钱柳提取物对羟自由基的清除率：水>石油醚>正丁醇>多糖>乙酸乙酯。见表2。表2 cps对·oh自由基的清除作用
讨 论
青钱柳为广西特有珍稀植物，对它的开发利用还十分有限，青钱柳既有明显的药理价值又具备一定的食品保健功能，进行工业化开发利用前景十分广阔。针对青钱柳叶中含有黄酮、多糖、内酯等多种有效成分，本实验提取了五种青钱柳提取物，考察青钱柳的体外抗氧化活性，为其药理作用提供科学依据。
脂质过氧化产物丙二醛等可导致人体细胞氧化损害、老化、致癌和动脉硬化等多种疾病。过氧化脂质大部分由肝细胞产生，其分解也主要在肝脏。mda是过氧化脂质的主要降解产物，其含量可反映脂质过氧化的程度。故mda的水平测定可用作检测抗过氧化作用。本实验结果表明，cps可明显降低小鼠自发性mda的生成，且活性与浓度有明显的量效关系。
羟自由基是反应药物抗氧化活性的重要指标。本实验利用fenton反应产生羟自由基：h2o2+fe2+=·oh+oh+fe3+。fe2+与邻二氮菲生成红色配合物，加入cps后，减弱了·oh对fe2+/邻二氮菲的氧化作用，引起自由基的变化，通过测定其吸光度值的变化，推断cps对·oh的作用。结果表明cps对羟自由基有较好清除作用，是天然高效的自由基清除剂。
cps较高的体外抗氧化活性可能与其中含有黄酮类化合物有关。黄酮类化合物具有的多酚结构，能提供活泼质子，与自由基结合成稳定的产物，因而有较强的抗氧化作用[5]。黄酮类成分具有保肝、扩冠、抗炎、降低血管脆性，解除痉挛，增强心脏收缩，还有一定程度的抗菌及抑制肿瘤细胞等作用。同茶叶相比，青钱柳黄酮类化合物含量相对较高，可作为这些物质的补充源[6]。
【参考文献】
[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[m].第21卷.北京：科学出版社，1979，18-19.
[2]谢明勇，李 磊.青钱柳化学成份和生物活性研究概况[j].中草药，2001，32(4)：365-366.
[3]柳板誉，梁彦兰.混交林中青钱柳生长规律的研究[j].江西农业大学学报，2004，26(3)：381-385.
[4]王著禄，陈海生，郑钦岳，等.商陆多糖的分离和纯化[j].第二军医大学学报，1990，11(1)：56.
[5]张培刚，郑鸿雁，昌有权，等.松针黄酮的体外抗氧化作用研究[j].食品科学，2005，26(9)：506-508.
[6]谢明勇，王远兴，温辉梁，等.青钱柳中黄酮甙和维生素含量的测定[j].食品科学，2001，22(1)：66-68.
作者：陈薇，段小群，卢 曦，黄忠仕，梁成钦作者单位：(1.桂林医学院附属医院，广西桂林 541001;2.桂林医学院，广西桂林 541004;3.右江民族医学院生物化学教研室，广西百色 533000)
