【摘要】 目的 探讨结缔组织生长因子（ctgf/ccn2）对肝癌细胞生物学行为的调控作用，及其与pparγ在肝癌中的相互关系。方法 免疫组织化学法检测hepg2细胞中ctgf及pparγ蛋白的表达。经不同浓度、不同时间的ctgf抗体封闭处理人肝癌细胞hepg2后,mtt法测定细胞活力,博依登小室测定细胞侵袭及迁移特性的改变。经pparγ激动剂(rosiglitazone,罗格列酮)处理hepg2细胞后， rtpcr 检测ctgf mrna表达的改变。结果 hepg2细胞表达ctgf及pparγ蛋白。肝癌细胞经ctgf抗体处理后，其增殖受抑制,且呈时间和剂量依赖性,同时细胞的侵袭、迁移能力也受到抑制。hepg2 细胞经罗格列酮处理后，其ctgf mrna的表达下降。结论 ctgf可以调控肝癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力。pparγ调控肝癌细胞的生长，部分是通过改变ctgf的表达来实现的。
【关键词】 ctgf; pparγ; 侵袭; 迁移; 人肝癌细胞
influence of ctgf on hepatocellular carcinoma cells and correlation with pparγ
cai wei, zhang fang, liu wei, yang aijun, wang chenyu, li min
institute of pathology, lanzhou university, lanzhou 730000, china
corresponding author: li min, email: limin0606@163.comabstract：objective to investigate the effect of connective tissue growth factor (ctgf/ccn2) on the growth of human hepatocellular carcinoma cells, and explore the correlation between pparγ and ctgf. methods the expression of ctgf and pparγ protein in hepg2 cell was detected by immunohistochemistry.hepg2 cells treated with the antibody of ctgf, at different concentrations for different periods. the proliferation of hepg2 cells was assessed by mtt. the change of invasion and immigration of hepg2 cells were detected by boyden. the mrna level of ctgf in hepg2 cells treated with rosiglitazone was detected by rtpcr. results hepg2 cells express ctgf and pparγ protein. mtt assay demonstrated that antibody of ctgf had inhibitory effect on the proliferation of hepg2 cells in a timeand dosedependent manner.the invasion and immigration of hepg2 cells were inhibited,too. the result of rtpcr demonstrated that the mrna level of ctgf was downregulated after treated with rosiglitazone. conclusion the antibody of ctgf could inhibit the proliferation, invasion and immigration of hepg2 cells. the mechanism of pparγ regulating the growth of hcc cell may be associated with downregulating the expression of ctgf.
key words：ctgf; pparγ; invasion; immigration; hepatocellular carcinoma cells
结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, ctgf/ccn2)是一种即刻早期反应基因,它属于ccn家族，与肿瘤细胞的增殖、肿瘤血管的发生等相关[1]。WwW.133229.coM过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activated receptors,pparγ)是一类核转录因子[2],同样具有调控肿瘤细胞分化,抑制增殖的作用。本实验观察了ctgf对肝癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响，以及与pparγ两者之间的相互关系。
1 材料与方法
1.1 细胞及主要试剂
人肝癌细胞株hepg2由兰州大学病理学研究所提供。四甲基唑蓝（美国sigma公司）。兔抗人多克隆ctgf抗体及pparγ抗体（武汉博士德生物工程有限公司）。鼠抗人单克隆ctgf抗体（美国santa cruz公司）。sp免疫组化染色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。鼠尾胶（本实验室自制）。pparγ激动剂罗格列酮（rgz）（浙江万马公司），完全溶于二甲基亚砜，dmso终浓度不超过0.1%。博依登小室（美国millipore公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 免疫组织化学法检测hepg2细胞中ctgf及pparγ蛋白的表达 取对数生长期的hepg2细胞，制成单细胞悬液后爬片。免疫组织化学染色按试剂盒说明操作。制片后光镜下观察细胞，细胞浆或细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性染色。
1.2.2 ctgf对人肝癌细胞hepg2增殖能力的影响 取对数生长期的hepg2细胞制成单细胞悬液,调整细胞密度为3×104／ml,悬浮于含10% fbs的rpmi1640培养液中，接种于96孔板,每孔200μl。待细胞贴壁后,吸去原培养基,加入含浓度分别为5、10、20、 50μg/ml ctgf抗体的新鲜rpmi1640培养液（含10%fbs）, 每个浓度设4个复孔,同时设立对照组(无fbs的rpmi 1640组作为mtt值的调零组，仅加入细胞未经抗体封闭组作为抑制率计算时的对照组a值)。在分别培养24、48、72h后,每孔加入mtt（5μg/ml）液 20μl, 继续孵育4h, 终止培养。小心吸弃培养上清液, 每孔加入二甲基亚砜150μl, 振荡10min, 酶标仪测570nm波长a值。重复3次试验, 取均值。按以下公式计算，抑制率(inhibition rate, ir)%=(1-实验组a 值/对照组a值) ×100%。
1.2.3 ctgf对人肝癌细胞hepg2侵袭能力的影响 博依登小室下室加入含40％ fbs的新鲜rpmi 1640培养液，终体积为200μl。将浓度为3g/l的自制鼠尾胶按每孔40μl均匀地铺在博依登小室上下室之间的孔径为8μm的滤膜的上室面上，置37℃ 30min聚合成凝胶。上室加入细胞密度为1.0×106/ml的hepg2单细胞悬液（细胞预先在不含fbs的rpmi 1640培养液中培养24h），上室终体积为300μl，将小室置于6孔板内，培养48h后用棉签擦掉鼠尾胶, pbs洗3次，95%乙醇固定，苏木素染色，相差显微镜观察、拍照并计数。每个滤膜分别计数随机5个视野内的穿膜细胞数后计算平均值。每组设3个平行小室,重复实验3次。
试验分为两组，a组：上室细胞不加处理组；b组：上室细胞预先用ctgf抗体封闭处理48h，抗体浓度为10μg/ml。
1.2.4 ctgf对人肝癌细胞hepg2迁移能力的影响 膜的上室面不铺鼠尾胶；上室细胞浓度为6.0×105/ml，其余同方法1.2.3。
1.2.5 rtpcr检测pparγ激动剂处理前、后ctgf的表达 marker由大连宝生物提供，序列号为d513a。rtpcr引物设计参照有关文献,经基因库核实,由上海生物工程公司合成。设计引物序列如下: ctgf的上游引物5′gcaggctagagaagcag
agc3′,下游引物5′atgtcttcatgctggtgcag3′, 产物大小为105bp；内参βactin的上游引物5′tggagaagagctatgagctgcctg3′，下游引物5′gtgccaccagacagcactgtgttg3′产物大小为202bp。细胞预先经pparγ激动剂处理（参照以往实验结果，激动剂浓度选择40μmol/l，处理48h），按trizol试剂盒说明书提取细胞中的总rna，反应条件为50℃逆转录30min, 94℃预变性5min，94℃变性30s,54℃退火1min,72℃延伸1min,进行35个循环，最后72℃延伸7min，琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统中拍照记录、分析结果。
1.3 统计学方法
采用spss 10.0软件, 所有指标采用±s表示, 组间比较采用一个样本的anova统计学方法处理，检验水准α=0.05，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫组织化学法检测人肝癌细胞hepg2中ctgf及pparγ蛋白的表达
结果显示，hepg2细胞中有ctgf及pparγ蛋白的表达，ctgf蛋白主要表达于细胞浆，见图1，pparγ蛋白主要表达于细胞核，细胞浆有部分表达，见图2。
2.2 ctgf对人肝癌细胞hepg2增殖能力的影响
经ctgf抗体封闭处理后， hepg2细胞的增殖受到明显抑制,且抗体浓度越大，抑制越明显,同一抗体浓度时，48h抑制率达到最大值。10～50μg/ml的ctgf抗体处理后，hepg2细胞的生长抑制与对照组相比，差异有统计学意义（p<0.01），而5μg/ml组与对照组相比，差异无统计学意义（p>0.05），见图3。
2.3 ctgf对人肝癌细胞hepg2侵袭及迁移能力的影响
侵袭实验结果显示:与ctgf抗体处理前（图4a, 蓝染的为苏木素染色的细胞核）相比，处理后（图4b）穿膜细胞数目减少, 差异有统计学意义(p<0.05)，见表1。迁移实验结果显示：与处理前相比， ctgf抗体封闭处理之后，穿膜迁移的细胞数目也有所减少, 变化趋势基本与侵袭实验一致, 差异亦有统计学意义(p<0.05)，见表1。
2.4 rtpcr检测pparγ激动剂处理前、后ctgf的表达表1 ctgf抗体处理前后侵袭及迁移细胞结果显示，hepg2细胞中有ctgf mrna的表达，pparγ激动剂处理后,ctgf mrna的表达降低，见图5。
3 讨论
目前所发现的ccn家族包括cry61、 ctgf、 nov、wisp1、wisp2和wisp3六个成员。1991年由bradham等[3]首先在人类脐静脉内皮细胞条件培养基中发现了人类的ctgf(hctgf)。对于ctgf的研究，以往主要集中在器官纤维化中，有研究显示[45]，在肾脏、肝脏等组织的纤维化过程中，ctgf可以通过多种途径调控组织纤维化的发生、发展过程。
ccn是一组功能复杂的基因, 随着近年来研究的逐步深入，ctgf对肿瘤的生长、侵袭、转移方面的影响越来越受到人们的关注。研究发现,胰腺癌、软骨肉瘤中ctgf的表达升高[6],在约61%的急性淋巴细胞白血病患者的骨髓中也出现ctgf的过度表达[7]。
我们的研究发现，ctgf的抗体封闭处理后，hepg2细胞的增殖明显受到抑制，呈剂量依赖关系，从时间上来讲，48h抑制率达到最大值。进一步在侵袭及迁移实验中发现，抗体封闭处理后，两项实验中穿膜的细胞数目相对于未处理组都有所减少。我们的结果证实了，ctgf对肝癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力都有所影响，提示在肝癌发生、发展过程中,ctgf可能发挥重要的调控作用。
过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators activated receptors,ppar) 是核激素受体超家族的成员,该受体有3 种亚型:pparα、pparγ和pparβδ，这3 种亚型在结构及功能上均有所差异。pparγ与配体结合后被激活，其配体包括天然配体和合成配体两类, 罗格列酮就是pparγ的合成配体之一。
研究表明，pparγ活化后抗肿瘤机制主要是通过调节细胞周期[8]、诱导凋亡[9]、抑制cox2的表达[10]等途径来实现。
基于pparγctgf途径的考虑,rtpcr检测经罗格列酮预先处理组及未处理组ctgf表达的改变发现，处理组ctgf的表达相对于未处理组下降，提示pparγ参与调控肝癌细胞hepg2的生长，部分是通过改变ctgf的表达来实现的。这就提示我们，在肝脏组织中，不仅在纤维化过程中pparγctgf途径发挥重要的作用，在肝癌的发生发展过程中，pparγctgf通路是同样存在并且发挥调控作用的。
我们的结果证实了ctgf对肝癌细胞的生物学行为发挥了重要的影响作用，而发现肝癌中pparγctgf途径无疑为我们的研究和临床治疗提供了一个新的方向。
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