【关键词】 唑来膦酸 骨肉瘤 黏附 迁移 侵袭 mmp2 mmp9
双膦酸盐是一种强有力的骨吸收抑制剂，被广泛的应用于治疗骨质疏松症，变形性骨炎和恶性肿瘤引起的高钙血症和骨痛症等[1]。除了强大的抗骨吸收功能外, 双膦酸盐抗肿瘤作用受到越来越多的重视。骨肉瘤是一种转移性的肿瘤，本研究探讨第三代双膦酸盐——唑来膦酸对骨肉瘤lm8细胞黏附、迁移、侵袭和基质金属蛋白酶(mmp2、mmp9)的影响，以评价唑来膦酸抑制骨肉瘤转移的效果。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器
唑来膦酸(择泰，瑞士诺华制药产品，北京诺华公司惠赠)；骨肉瘤细胞株lm8购于第四军医大学实验动物中心；rpmi1640培养液为hyclone公司产品;小牛血清为兰州民海生物公司产品；纤连蛋白（fn）购自sigma公司；基质胶matrigel购自collaborative rsearch 公司；transwell小室为corning公司产品；cck8试剂盒为日本同仁化学研究所dojindo laboratories产品；mmp2和mmp9 elisa试剂盒为oncogene公司产品。WwW.133229.Com美国shellab2300型恒温co2细胞培养箱，日本olympus bh2型光学显微镜，美国biotect 2550型自动酶标光度仪等。
1.2 细胞培养
骨肉瘤细胞株lm8贴壁生长于含10％新生牛血清(ncs)rpmi1640培养液中，于37℃、5％ co2的饱和湿度孵箱中培养。生长至70％～80％融合时将细胞用0.25％的胰酶消化后传代，取对数生长期细胞作后续实验。
1.3 细胞黏附试验
将10μg/ml的fn以50μl/孔加入96孔板，4℃包被基膜过夜，次日水化基底膜，即吸出残余液体，每孔加入100μl含10g/l bsa的pbs,37℃孵育1h。分别取6.25、12.5、25.50、100μmol/l不同浓度唑来膦酸处理24h的lm8细胞，经洗涤、消化后用prmi1640液稀释，调细胞浓度为5×105/ml，分别加入到处理后的96孔板，每孔100μl，每组平行设3个复孔，37℃、5％ co2条件下温育1h，温育结束后弃去各孔培养液，pbs冲洗除去未黏附细胞，弃pbs后加100μl培养液和10μl的cck8试剂，37℃、5％ co2条件下孵育4h后用酶标仪测各孔450nm od值。黏附抑制率(%)＝1-(实验组od值／对照组od值)×100％
1.4 细胞迁移试验
将处于对数生长期的lm8细胞接种于6孔培养板中,置37℃、5% co2及饱和湿度的培养箱中培养。待细胞覆盖孔底80%以上时,在单层细胞表面用200μl枪头在孔中划一直线后,用pbs 漂洗2次以去除划下的悬浮细胞，加入不同浓度的唑来膦酸的培养基继续培养24h;倒置显微镜下观察划痕中细胞迁移情况。
1.5 细胞侵袭实验
在transwell上室聚碳酸酯膜上涂1mg／ml的matrigel 50μl，37℃、30min使之在微孔滤膜上重组为基底膜结构。取指数生长期lm8细胞，以0.25％胰酶消化、离心、计数后，以0.1％ bsa的rpmi1640培养液调整细胞数1×106／ml，取细胞100μl接种于transwell上室内，加入唑来膦酸的培养基处理细胞，每组3个复室；下室加入含0.1％ bsa的rpmi1640培养液600μl，置37℃、5％ co2培养箱中48h。培养结束，将滤膜以甲醇固定，棉签擦掉膜表面细胞，然后用giemsa 染料染色10min。200倍光镜下选择膜上下左右中5个不同视野的穿过膜的细胞数,按下式计算药物对肿瘤细胞的侵袭抑制率。抑制率(%)＝1-(实验组平均侵袭细胞数/对照组平均侵袭细胞数) ×100％
1.6 cck8法检测细胞毒性
取对数生长期lm8细胞， 以rpmi1640培养基调整细胞浓度至5×104／ml 加入96孔培养板中，每孔加细胞悬液100μl, 24h后吸弃培养基，加入含不同浓度唑来膦酸的rpmi1640培养基，置于37℃、5％ co2的饱和湿度孵箱中培养， 48h后取出培养板，每孔加入10μl cck8，继续培养4h后,用酶标仪在450nm处测定每孔光吸收值（a值），并计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率(%)=（1-实验组a值/对照组a值）×100%
1.7 酶联免疫吸附实验(elisa)检测mmp2和mmp9
0、6.25、12.5和25μmol/l浓度的唑来膦酸作用lm8细胞48h后，运用elisa试剂盒按其操作说明书对细胞培养的上清液进行检测，在酶联免疫检测仪上测450nm波长的吸光度值。通过标准品的a值和已知浓度绘制出标准曲线，在标准曲线上找出各a值对应的浓度。
1.8 统计学方法
所有实验数据结果以±s表示，应用spss 11.5统计分析软件,各组间比较行单因素方差分析, p＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 唑来膦酸对lm8细胞黏附力的影响
唑来膦酸可以显著抑制lm8细胞在纤连蛋白（fn）的黏附。6.25μmol/l、12.5μmol/l、25μmol/l、50μmol/l和100μmol/l的唑来膦酸作用24h后，黏附抑制率分别为（22.1±3.2）%、（34.7±3.5）%、（45.9±2.3）%、(54.3±2.5)%和(71.7±2.8)%，各组间抑制率比较差异均有统计学意义(f =127.631, p<0.05)。
2.2 唑来膦酸对lm8细胞迁移力的影响
实验组和对照组划线后在镜下视野中可见一条细长等宽的无细胞划痕区。24h后对照组细胞运动迁移基本上覆盖了大部分划痕区，而实验组随着唑来膦酸的浓度增大，lm8细胞向划痕区移动的距离越来越小，划痕区依然明显存在，见图1。可见唑来膦酸能明显抑制骨肉瘤lm8细胞的迁移力，且唑来膦酸的浓度越大抑制细胞迁移作用越明显。
2.3 唑来膦酸对lm8细胞侵袭力的影响
不同浓度唑来膦酸处理的lm8细胞48h后， lm8细胞浸润穿过人工基底膜matrigel的能力通过transwell小室得到测定。 唑来膦酸处理组的lm8细胞浸润穿过matrigel膜的细胞数要比对照组的细胞数明显减少, 见图2。 6.25μmol/l和12.5μmol/l、a为经过划线和给药继续培养时的细胞情况; b、c、d分别为0、 6.25和12.5μmol/l的唑来膦酸作用24h后的细胞迁移情况(倒置显微镜 ×100)
图1 唑来膦酸对lm8细胞迁移力的影响
a、b、c、d分别为0、6.25、12.5和25μmol/l浓度的唑来膦酸作用48h后穿过matrigel膜的细胞(giemsa染色, ×200)
图2 唑来膦酸对lm8细胞侵袭力的影响
25μmol/l浓度的唑来膦酸对lm8细胞侵袭力的抑制率分别为（25.6±3.6）%、（42.1±3.7）%和（70.2±5.3）%，各组间差异具有统计学意义(f=110.909, p<0.05)。说明唑来膦酸以剂量依赖的方式抑制lm8细胞的浸润能力。
2.4 唑来膦酸对lm8细胞毒性的测定
结果显示6.25μmol/l、12.5μmol/l、25μmol/l、50μmol/l和100μmol/l浓度的唑来膦酸对lm8细胞生长抑制率分别为（7.0±1.4）%、（14.7±3.0）%、（30.6±2.2）%、（53.7±3.4）%和（77.1±1.7）%，组间差异具有统计学意义（f=405.589,p<0.05）。说明6.25μmol/l、12.5μmol/l的唑来膦酸作用48h后对lm8细胞的毒性作用相对不明显。
2.5 唑来膦酸对lm8细胞分泌mmp2和mmp9的影响
结果显示唑来膦酸能显著抑制mmp2和mmp9的分泌，其抑制基质金属蛋白酶（mmp2、mmp9）效应和唑来膦酸呈剂量依赖关系，各组间两两比较有统计学意义（mmp2组： f=58.959、p<0.05；mmp9组：f=73.798、p<0.05），见表1。
3 讨论
肿瘤转移始于恶性侵袭，而侵袭是贯穿肿瘤转移全过程的重要步骤。已有实验证实，肿瘤细胞首先通过膜表面的受体与基底膜、基质成分层粘连蛋白、纤粘连蛋白和胶原蛋白结合；然后肿瘤细胞分泌表1 唑来膦酸对lm8细胞分泌基质金属蛋白酶的影响或利用细胞膜上的多种蛋白酶降解基底膜和基质；最后肿瘤细胞定向运动穿越破损的基底膜和基质部位而实现转移[2]。抗肿瘤细胞侵袭及转移药物一般是通过上述各个步骤来发挥作用的。
癌细胞侵袭转移中，细胞骨架参与配体—整合素—细胞骨架系统的信息传递，通过构型改建调控细胞形态及运动行为的改变,同时还影响着金属蛋白酶的分泌及基因的表达[3,4]。实验显示，唑来膦酸能显著下调lm8细胞对fn的黏附力。kubista等[5]报道唑来膦酸明显破坏骨肉瘤细胞的微管等细胞骨架。分析其机制，我们认为唑来膦酸抑制lm8细胞的黏附力可能和微管系统的破坏密切相关。唑来膦酸能够通过破坏微管系统，影响细胞骨架构型的改建，阻断配体—整合素—细胞骨架系统的信号传递，进而抑制整合素的亲和力及细胞外形的铺展，从而下调lm8细胞的黏附能力。此外配体—整合素—细胞骨架系统还可以通过ip3、ca2+ 等各种信号传递机制，来调节细胞的运动性，诱发癌细胞的迁移[6,7]，图1显示，唑来膦酸破坏微管系统，阻断配体—整合素—细胞骨架系统的信号传递，进而抑制lm8细胞的运动能力。
本实验中lm8细胞在趋化剂诱导下穿过transwell小室底部涂有matrigel的聚碳酸酯膜，通过统计穿过膜的细胞数，观察药物对lm8细胞侵袭能力的影响。实验结果显示，唑来膦酸能显著抑制lm8细胞的侵袭力，6.25μmol/l、12.5μmol/l、25μmol/l浓度的唑来膦酸对lm8细胞侵袭力的抑制率分别为（25.6±3.6）%、（42.1±3.7）%和（70.2±5.3）%，但是唑来膦酸能抑制lm8细胞增殖，从而影响穿过膜的细胞数，一定程度上抑制其侵袭力。我们实验显示唑来膦酸抑制细胞增的因素虽然存在，但是起次要的作用, kubo等[8]在研究另外一种双膦酸盐min，发现甚至在1μmol/l的很低浓度，也能明显抑制恶性骨肿瘤细胞的侵袭力，如用1μmol/l的min处理saos2骨肉瘤细胞72h后，79.2％的肿瘤细胞失去了侵袭力，而其活性只降低了0.6％。这个结论和本实验结果基本一致。但是其抑制侵袭力效应的差异可能和不同的双膦酸盐药物、不同的骨肉瘤细胞株有关。因此唑来膦酸抑制lm8细胞的侵袭力主要是抑制细胞侵袭过程的本身，而不是主要因为唑来膦酸的细胞毒作用。
细胞外基质（ecm）降解是肿瘤侵袭的关键步骤，而基质金属蛋白酶（包括mmp2和mmp9）是降解ecm的主要酶类[9]。本研究elisa结果提示，唑来膦酸能有效抑制基质金属蛋白酶（mmp2和mmp9）的表达。这在cheng等[10]研究中得到了部分的证实，阿仑膦酸呈剂量和时间依赖性抑制mmp2 mrna的转录和mmp2蛋白的表达，从而抑制骨肉瘤细胞的侵袭力。
综上所述，唑来膦酸显著抑制lm8细胞的黏附、迁移及侵袭力，并显著下调基质金属蛋白酶（mmp2和mmp9）的表达。实验结果提示，唑来膦酸能够有效抑制骨肉瘤细胞的侵袭和转移。而唑来膦酸等双膦酸盐对骨组织尤其是骨转换活跃区域具有很高亲和力，从一定程度上作为天然的骨靶向剂，可以在骨肉瘤中积聚很高的浓度，从而发挥细胞毒性作用和抑制骨肉瘤细胞的转移，有着广阔的临床应用前景。
(致谢:感谢北京诺华公司连睿老师对本实验的支持与帮助。)
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