【摘要】 目的探讨食管鳞癌组织中凋亡抑制蛋白livin和促凋亡基因smac蛋白的表达及其与食管鳞癌临床生物学指标的关系。方法应用免疫组化sp法对62例食管鳞癌组织、31例癌旁不典型增生组织及62例正常食管黏膜组织进行livin和smac蛋白的检测，分析其阳性表达与食管鳞癌患者临床病理因素的关系。结果62例食管鳞癌组织中，组织学分级ⅰ级15例、ⅱ级25例、ⅲ级22例；有淋巴结转移20例；肿瘤浸润至黏膜层、黏膜下层或浅肌层7例、深肌层14例、纤维膜41例。livin蛋白在正常食管黏膜组织中低表达，在癌旁不典型增生组织及食管鳞癌组织中高表达，阳性率分别为38.7%（24/62）、61.3%（19/31）和80.6%（50/62），差异有统计学意义（χ2=22.742，p<0.05）；smac蛋白在癌旁不典型增生组织中高表达，在正常食管黏膜组织及食管鳞癌组织中低表达，阳性率分别为67.7%（21/31）、48.4%（30/62）和33.9%（21/62），差异也有统计学意义（χ2=9.688，p<0.05）。食管鳞癌患者癌组织中livin和smac蛋白的表达与性别、年龄无关；与组织学分级、浸润深度及有无淋巴结转移有关（p<0.05）。livin和smac蛋白在食管鳞癌组织中的表达呈负相关（r=－0.426，p<0.05）。结论livin和smac在食管鳞癌组织中呈现异常表达，提示两者参与了食管鳞癌的发生发展和浸润转移。
【关键词】 食管鳞癌；凋亡抑制蛋白livin；促凋亡基因smac；免疫组织化学
zhao qiumin1,2
1. department of pathology, the first affiliated hospital, zhengzhou university, he'nan key laboratory of tumor pathology, zhengzhou 450052, china;2.editorial board of journal of zhengzhou university(medical sciences)abstract：objective to investigate the expression of livin and smac proteins in esophageal squamous cell carcinoma (escc) tissue and their relationship to the progression of escc.methodsexpressions of livin and smac proteins were respectively detected by immunohistochemistry sp method in 62 cases of escc, in 31 cases of paracancerous atypical hyperplasia, and in 62 cases of normal esophageal mucosa. then the relationships between livin and smac protein expressions and clinicopathologic features of escc patients were estimated.resultsof the 62 escc patients, ther diagnosis of escc were confirmed by histopathological detection, 15 cases were grade ⅰ, 25 cases were grade ⅱ, 22 cases were grade ⅲ; 20 cases have lymph node metastasis; and 7 cases were followed with invasion of mucosa, submucosa, or shallow layer, 14 cases have invasion of deep muscle, 41 cases have invasion of fiber membrane. livin protein were lower expressed in normal esophageal mucosa, but high expressed in paracancerous dysplasia and esophageal cancer tissues, and the difference among the 3 groups was statistically significant (χ2=22.742，p<0.05). smac protein were overexpressed in paracancerous dysplasia, but less expressed in normal esophageal mucosa and esophageal cancer tissues, and the difference among the 3 groups was statistically significant (χ2=9.688,p<0.05). livin and smac protein expressions in escc tissues were not affected by the patients' gender and age, however it was significantly correlated with the histological grade, depth of invasion or lymph node metastases (p<0.05). the expression of livin and smac proteins was negatively correlated with the progression of essc （r=－0.426，p<0.05）.conclusionabnormal expression of livin and smac occured in escc, which suggested that livin and smac play important role in the development, invasion and metastasis of escc.
key words：escc；livin；smac；immunohistochemistry
1资料与方法
1.1资料62例食管癌标本来自2006年2月26日~3月16日河南省安阳市肿瘤医院择期手术切除的食管癌患者，患者术前均无化疗、放疗及免疫治疗史；男36例，女26例，年龄38～75 (60.6±7.5) 岁。Www.133229.CoM标本均在离体30min内迅速取材，分别取自癌灶、癌旁3cm内及手术残端食管组织，经40g/l多聚甲醛液固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，切片厚度3～5μm，分别用于he、免疫组织化学染色。
1.2方法 livin、smac mab均为santa cruz公司产品。sp免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组织化学染色采用sp法，操作严格按说明书进行。石蜡切片常规脱蜡和水化后，浸于edta液（ph 9.5），高压修复组织抗原20min。pbs洗涤；封闭内源性过氧化物酶；pbs洗涤；非免疫性动物血清孵育10min；livin、smac mab孵育60min（工作浓度1∶100）； 生物素标记的第二抗体孵育10min；pbs洗涤；链霉素标记的亲和素过氧化物酶孵育10min；pbs洗涤；dab显色，蒸馏水冲洗，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以pbs液代替一抗作为阴性对照，阳性对照为已知livin、smac蛋白表达阳性的乳癌、肺癌组织切片。
1.3结果判断标准[56] 食管鳞癌组织中livin蛋白阳性细胞主要表达于胞质，呈黄色或棕黄色颗粒样信号；smac蛋白阳性信号定位于胞质，呈黄色或棕黄色颗粒。①根据阳性细胞在同类细胞中所占比例计分：阳性细胞<10%计0分；10%~25%计1分；26%~50%计2分；>50%计3分。②按阳性细胞染色强度计分：不着色为0分；淡黄色为1分；黄色为2分；棕黄色为3分。2项相加0~1分为阴性，2~3分为+，4~5分为++，6分为+++（>4分为过表达，计为阳性）。
1.4统计学方法 应用spss10.0统计学软件，统计分析方法为χ2检验和spearman相关性分析。检验水准为0.05。
2结果
2.162例食管癌组织病理学检测的结果 以he切片病理组织学检测，证实62例癌组织标本均为鳞癌，组织学分级ⅰ级15例，ⅱ级25例，ⅲ级22例；伴淋巴结转移者20例，无淋巴结转移者42例；肿瘤浸润深度：浸润至黏膜层、黏膜下层或浅肌层7例；深肌层14例，纤维膜41例。62例癌旁3cm以内的标本中有31例呈中重度不典型增生；62例手术残端食管组织均为正常鳞状上皮。
2.2食管黏膜组织中livin和smac蛋白阳性表达的分布及定位 鳞癌组织中，livin阳性细胞分布在细胞增生活跃区，如癌细胞珠的周边区域或呈中、低分化的癌细胞团内，而且着色较深，见图1c。癌旁不典型增生组织中的染色和定位区域类似于癌组织，见图1b。正常食管黏膜组织中仅有少量livin阳性表达，见图1a。从正常鳞状上皮→癌旁不典型增生→鳞癌组织，livin阳性信号呈细胞膜→细胞膜和（或）细胞浆→细胞浆和（或）细胞核表达。而smac蛋白在鳞癌组织中低表达，见图2c；癌旁不典型增生组织中smac蛋白表达高于癌组织，见图2b，且smac蛋白阳性信号主要呈膜表达；大部分正常食管黏膜组织中smac蛋白高表达，而部分正常食管黏膜组织中smac蛋白的表达与鳞癌组织中的表达相近，见图2a。
2.3livin和smac蛋白表达与食管鳞癌临床生物学的关系
livin蛋白在正常黏膜组织、癌旁不典型增生组织和食管鳞癌组织中的阳性率分别为38.7%（24/62）、61.3%（19/31）和80.6%（50/62）；癌旁不典型增生组织和食管鳞状细胞癌组织中cyclinb1阳性率高于正常黏膜组织(χ2=22.742，p<0.05)。
smac蛋白在正常黏膜组织、癌旁不典型增生组织和食管鳞癌组织中的阳性率分别为48.4%（30/62）、67.7%（21/31）和33.9%（21/62）；癌旁不典型增生组织和食管鳞癌组织中smac蛋白阳性率明显低于正常食管黏膜组织(χ2=9.688，p<0.05)，见表1。不同性别、年龄间livin、smac蛋白的表达差异无统计学意义，而不同组织学分级、浸润深度及有无淋巴结转移间livin、smac蛋白的表达差异有统计学意义，见表2。表1食管黏膜组织中livin、smac蛋白的表达
2.4食管鳞癌组织中livin蛋白和smac蛋白表达之间的关系 食管鳞癌组织中livin蛋白和smac蛋白表达成负相关，相关系数为－0.426（p<0.05），见表3。
3讨论
细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自主性进行的程序性死亡，是生物界中重要的生命现象之一，对保持组织的健康和正常生长有十分重要意义。细胞凋亡通路和p53、cmyc、bcl2家族、smac、iaps及胞内信号转导等通路构成一个复杂的网络对凋亡进行精细的调控。人类iap家族现有8个成员，即niap、xiap（ilp 1/miha）、ciap 1（hiap 2/mihb）、ciap 2（hiap 1/mihc）、survivin（tiap）、apollon（bruce）、ilp2（ts iap）和livin（mliap/kiap）。livin是iap家族中的新成员，其基因位于染色体20 q13.3，全长46kb，有α及β两种异构体，分别编码长度为298及280个氨基酸的蛋白质[7]。近年来已有在结直肠癌[8]、膀胱癌[9]和肺癌[1011]等实体瘤组织和血清中检测出livin和抗livin抗体异常表达的研究报道，并且认为livin对评价某些肿瘤的预后具有一定价值，有可能成为某些肿瘤诊断和治疗的一个新的潜在靶点。smac是du等[12]从hela细胞中分离出一种新型线粒体蛋白质,命名为第2个线粒体衍生的胱天蛋白酶激活剂(second mitochondriaderived activator caspase)。同时，verhagen等[13]从293t细胞中分离出一种蛋白质，命名为低等电点凋亡抑制蛋白(iaps)直接结合蛋白(direct iap binding proteinwith low pi，diablo)。经过对比分析，smac和diablo完全等同，合并称为smac/diablo。免疫分析确定smac/diablo定位于线粒体内，凋亡刺激(包括抗癌药物、电离辐射、化学信号和dna损伤)可使其与细胞色素c(cyt c)一同从线粒体膜间区释放出来，发挥促凋亡作用。人类smac/diablo基因位于12号染色体长臂,由7个外显子组成。smac mrna全长1.5kb，编码239个氨基酸的开放性阅读框，最初合成的前体蛋白相对分子质量约27000[14]。目前，细胞凋亡中主要的途径包括死亡受体途径和线粒体途径，这两条途径都有caspases家庭成员的参与。iaps正常情况下，与caspase结合而使其丧失活性，从而抑制细胞凋亡。smac/diablo在凋亡刺激物作用下，从线粒体中释放出来，和iaps结合，解除其对caspase的抑制作用，进而发挥促凋亡作用[15]。我们发现，从正常鳞状上皮→癌旁不典型增生→鳞癌组织，livin蛋白的阳性表达率逐渐上升，阳性率分别为38.7%（24/62）、61.3%（19/31）和80.6%（50/62），差异有统计学意义 (χ2=22.742，p<0.05)；且livin阳性信号呈细胞膜→细胞膜和（或）细胞浆→细胞浆和（或）细胞核表达，其原因有待于进一步研究。另外，livin的表达与食管癌的组织学分级、浸润深度和淋巴结转移有关，浸润至食管纤维膜的livin阳性表达率显著高于浸润至食管肌层的阳性表达率，有淋巴结转移的livin阳性表达率显著高于无淋巴结转移的阳性表达率，本研究结果与黄青远等[5]报道相符。提示livin参与了食管癌的进展，有可能作为食管癌患者预后不良的参考指标之一。我们的研究结果还显示，食管癌组织中smac的阳性表达率明显低于癌旁不典型增生组织和食管正常组织，从鳞癌组织→癌旁不典型增生→正常鳞状上皮，smac的阳性表达呈现由低到高而后又降低的趋势。我们的研究结果还发现，smac的表达与食管癌的组织学分级、浸润深度和淋巴结转移有关，浸润至食管纤维膜的smac阳性表达率显著低于浸润至食管肌层的阳性表达率，有淋巴结转移的livin阳性表达率显著低于无淋巴结转移的阳性表达率，提示smac的表达降低可能与食管癌的发生、发展有关，另外我们还发现livin和smac蛋白在食管鳞癌组织中的表达呈负相关。我们将构建smac基因的腺病毒载体，转染食管癌细胞系，进一步研究高表达smac基因对食管癌细胞中livin蛋白表达和细胞凋亡的影响。致谢：感谢导师张云汉教授和郑州大学第一附属医院病理科、河南省肿瘤病理重点实验室李惠翔教授、陈奎生教授对本课题的指导；感谢任秀花老师、高冬玲老师、张岚老师、庞霞老师和李晟磊、赵志华、刘宗文、张功员等同学对本实验的帮助！表2livin，smac蛋白表达与食管鳞癌临床生物学的关系表3食管鳞癌组织中livin蛋白和smac蛋白表达的关系
【参考文献】
［1］takeuchi h,kim j,fujimoto a,et al.xlinked inhibitor of apoptosis protein expression level in colorectal cancer is regulated by hepatocyte growth factor/cmet pathway via akt signaling[j].clin cancer res,2005,11(21):76217628.
[2]yagihashi a,ohmura t,asanuma k,et al.detection of autoantibodies to survivin and livin in sera from patients with breast cancer[j].clin chim acta,2005,362(12):125130.
[3]hariu h,hirohashi y,torigoe t,et al.aberrant expression and potency as a cancer immunotherapy target of inhibitor of apoptosis protein family,livin/mliap in lung cancer[j].clin cancer res,2005,11(3):10001009.
[4]gaither a, porter d, yao y,et al.a smac mimetic rescue screen reveals roles for inhibitor of apoptosis proteins in tumor necrosis factoralpha signaling[j].cancer res,2007,67(24):1149311498.
[5]黄青远,赵志龙,崔肃,等.livin在食管癌中的表达及与bcl2相关性研究[j].现代肿瘤医学,2007,15(3):326328.
[6]赵进明,朱志华,吴秋良,等.smac在ⅰ～ⅱ期非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义[j].癌症,2006,25(5):631634.
[7]kasof gm,gomes bc.livin,a novel inhibitor of apoptosis protein family member[j].j biol chem,2001,276(5):32383246.
[8]li jh,he wj,he yj.expression and clinical significance of survivin and livin in dukesob colorectal cancer[j].ai zheng,2007,26(5):547551.
[9]song t,hong bf,gao jp,et al.expression of apoptosis inhibitor gene livin in bladder transitional cell carcinoma and clinical implication thereof[j].zhonghua yi xue za zhi,2007,87(12):806807.
[10]yuan d,liu l,gu d.transcriptional regulation of livin by betacatenin/tcf signaling in human lung cancer cell lines.transcriptional regulation of livin by betacatenin/tcf signaling in human lung cancer cell lines[j].mol cell biochem,2007,306(12):171178.
[11]crnkovic′mertens i,muley t,meister m,et al.the antiapoptotic livin gene is an important determinant for the apoptotic resistance of nonsmall cell lung cancer cells[j].lung cancer,2006,54(2):135142.
[12]du c,fang m,li y,et al.smac,a mitochondrial protein that promotes cytochrome cdependent caspase activation by elimination iap inhibition[j].cell,2000,102(1):3342.
[13]verhagen am,ekert pg,pakusch m,et al.identification of diablo,mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizin iap proteins[j].cell,2000,102(1):4353.
[14]王志成,龚守良.smac/diablo与肿瘤[j].中国实验诊断学,2006，10(8):942945.
[15]chang h,schimmer ad.livin/melanoma inhibitor of apoptosis protein as a potential therapeutic target for the treatment of malignancy[j].mol cancer ther,2007,6(1):2430.
