1 材料与方法
1.1 资 料
1.1.1 资料来源及诊断标准
收集自2004年3月至2006年3月在青岛大学医学院附属医院妇科手术的宫颈癌前病变的患者标本共114例，均为经病理证实的未行放化疗的手术标本，由同一病理医师回顾检查。所有入选的患者均为青岛地区的居民，年龄27~65岁，平均40.4±7.60岁。其中，cinⅰ26 例，cinⅱ 22 例，cinⅲ 66例。所有标本均经常规甲醛固定，石蜡包埋，标本保存时间在1～2年内。每个标本均切取组织3片(每片厚10μm)置入1.5ml ep中，室温保存。
1.1.2 主要试剂
蛋白酶k购自amresco公司，琼脂糖购自bbi分装，dl2000购自takara公司。makeⅰ购自天为时代生物有限公司，4种核糖核酸及taq dna多聚酶购自大连宝生物工程有限公司。
1.2 方 法
1.2.1 石蜡组织中总dna的提取
加二甲苯1.5ml于装有组织切片的离心管中，轻微震荡，于37℃水浴放置1h，12 000r/min离心5min，弃上清，重复1次。Www.133229.Com加入1.0ml无水乙醇，混匀，室温放置10min，弃上清，重复1次。开盖的离心管置于55℃恒温器干燥组织，直到组织完全干燥。用250μl消化液(50mmol/l tris，ph8.5，200mg/l蛋白酶k)悬浮组织，37℃反应过夜或55℃ 3h，直到组织消化到透亮。然后煮沸10min，灭活蛋白酶k，12 000r/min离心5min，吸上清直接做pcr或分装后放在－20℃保存。用gapdh引物进行pcr扩增验证dna提取成功与否。
1.2.2 hpv16.18.33.58.dna 检测
利用primer5.0 设计hpv16.18.33.58的特异性的引物进行pcr扩增，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列见表1。
选用25μl扩增体系，内含模板dna 3μl，10×buffer 2.5μl，25mmol/l mgcl2 2.5μl，10mm/l dntps 0.5μl，10μmol/l的上、下游引物各1.25μl，taq dna聚合酶1u，pcr专用水13.8μl。hpv16的扩增条件：94℃预变性5min，94℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 120s，共40个循环，最后72℃延伸10min。hpv18的扩增条件：94℃预变性5min，94℃ 60s，58℃ 60s，72℃ 120s，共40个循环，最后72℃延伸10min。hpv33的扩增条件：94℃预变性5min，94℃ 60s，56℃ 60s，72℃ 120s，共40 个循环，最后72℃延伸10min。hpv58的扩增条件：94℃预变性5min，94℃ 60s，60℃ 60s，72℃ 120s，共35个循环，最后72℃延伸10min。gapdh的扩增条件：94℃预变性5min，94℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 90s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
阳性结果的判断：取pcr 终产物5μl加1μl上样缓冲液点样于2%琼脂糖凝胶中，80v电泳30min以maker作为参照物。在紫外灯下观测结果并照相，被溴化乙锭染色的dna在maker的相应位置上出现的桔红色荧光带即为阳性,否则为阴性。
1.2.3 统计学处理
所有的数据输入计算机，采用spss11.5统计软件进行统计学分析，采用χ2检验，p<0.05认为有统计学意义。对多重感染患者，各基因型阳性率重复计算。
2 结 果
2.1 各高危型hpv在cin患者中的感染情况
宫颈上皮内瘤变的患者114例中，4种高危型hpv的总阳性例数为94例，在宫颈上皮内瘤变的患者中hpv总的感染率为82.46％，见表2。4种高危型hpv的总感染率在cin ⅰ，cin ⅱ，cin ⅲ组分别为53.85％，72.73％，96.97％。三组之间比较χ2值为25.762，p<0.001，cin ⅲ组高危型hpv的感染率明显高于cin ⅰ组（χ2=26.885，p<0.001）；cin ⅲ组高危型hpv的感染率也明显高于cin ⅱ组，差异有显著性（χ2=11.733，p<0.01）；cin ⅱ组高危型hpv的感染率虽然高于cin ⅰ组，但无统计学意义。
2.2 各高危型hpv在cin中感染的分型情况
在宫颈上皮内瘤变的患者中，各型hpv的总感染率见表3。各型hpv的感染率之间的差异有显著性（χ2=42.632，p<0.001）。4种高危型hpv的感染率从高到低依次为：hpv16，hpv58，hpv18，hpv33。
3 讨 论
目前流行病学研究和生物学研究已经明确hpv感染为宫颈癌前病变和浸润性宫颈癌发生的必要条件，特别是高危型hpv的感染强烈预示着宫颈上皮内瘤变的存在。在本研究中，4种高危型hpv在宫颈上皮内瘤变患者中总的感染率为80.07％，这进一步证实了hpv感染与宫颈疾病的关系。在这些患者中有20例cin 患者是hpv阴性的，这些患者有可能感染了其他型别的hpv，也有可能同时还存在其他因素的协同作用，即hpv感染并不是单一的致癌因素。
随着分子生物学技术的发展，目前已分离鉴定出110余种hpv dna，其中30多种与宫颈感染和病变有关，根据其致病力的大小分为高危型和低危型两种，高危型hpv与宫颈癌前病变及其宫颈癌的关系最为密切。不同地区hpv的人群感染率不同，所携带的型别不同，与宫颈癌相关的型别也不尽相同。很多学者对世界范围内的ｈｐｖ感染的地区差异进行了大量的研究，世界癌症研究中心的clifford等[4]应用meta分析对8 308例低度鳞状上皮内瘤变患者（来自55篇已发表的论文）中的hpv感染的研究发现，最主要的是hpv16，其次依次为hpv31，hpv51，hpv53。而duttagupta c等[5]报道，对22 个国家和地区、32 所医院的1 035 例宫颈癌患者用pcr方法进行测定，发现排在前4位的依次为hpv16，hpv18，hpv45，hpv31。近年来亚洲的学者在这方面也做了很多的工作，lee 等[6]对南韩地区的患者利用hd-c进行hpv分型的结果为：hpv16最常见，其余依次为hpv58，hpv18，hpv52。日本学者的研究也表明hpv16和hpv58为最常见的两种类型。而sowjanya等[7]对印度宫颈癌患者高危型hpv的分型发现，最常见的类型从高到低依次为：hpv16(66.7%)，hpv18(19.4%)，hpv33(5.6%)，hpv35(5.6%)。
我国在这方面研究也很多，hpv58在中国东南地区的检出率较高。江西省的主要型别为hpv16，58，33，31。同样香港地区的主要型别也为hpv16，58。高艳娥等[8]应用荧光偏振对上海地区确定了感染型别的研究中，前4位的依次为：hpv16，hpv18，hpv58，hpv31。lin等[9]在中国台湾南部地区的hpv感染的患者中的主要型别为：hpv16，hpv52，hpv58。我们对青岛地区主要高危型hpv感染进行了研究，结果表明青岛地区高危型hpv在宫颈上皮内瘤变患者中感染的主要型别依次为hpv16，hpv58，hpv18，hpv33。青岛地区的主要感染型别与欧洲及世界范围内的报道有很大的不同。本研究的结果表明，在青岛地区存在着世界范围内比较常见的hpv16 和 hpv18型，同时hpv58的感染率也很高，超过了hpv18，这与中国东南地区的研究比较符合，同时和亚洲的韩国和日本的报道也比较一致，这与世界范围内的研究和欧洲美洲等西方国家的研究不同。同时在该地区也存在着在中国报道较少的hpv33的感染，进一步证实了hpv感染的地区差异。这将为该地区宫颈疾病的筛查提供了理论依据。但本研究仅对比较常见的4种类型的hpv进行了研究，有可能还存在其他类型的感染，我们将在这方面做进一步的研究。
有研究[10]表明若重复感染同一型别的高危型hpv的妇女进展为宫颈高度病变的相对危险度(or)高达813.0，重复感染某一高危型hpv将使其癌变的机会增加，这提示我们不仅要检测出hpv dna的存在，还要对其进行分型。美国的mao等[11]的一项最新的研究表明，预防性hpv16 l1 vlp疫苗能够提供对于hpv16的持续感染及与之相关的cin ⅱ~ⅲ病变至少3.5年的免疫力。对高危型hpv进行分型，能使我们清楚地了解本地区的高危型hpv的主要感染型别，从根本上预防宫颈疾病的发生即型特异宫颈疫苗的研制提供理论帮助，即我们不仅要研究hpv16~18的疫苗，更要提高对感染率较高的hpv58的注意。
有研究[12]表明，hpv16、18、52 dna的高负荷是从cin ⅱ~ⅲ到宫颈癌转化过程中的先决条件，hpv dna的感染状态和病毒负荷是不同型别的hpv癌变过程中的重要因素。因此，对宫颈疾病中的高危型hpv进行分型，检测其感染状态和病毒负荷，对预测宫颈疾病的癌变具有重要的意义。
【参考文献】
[1] munoz n, bosch fx, sanjose s, et al. epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer[j]. n engl j med, 2003, 348(6):518-527.
[2] einstein mh,goldberg gl.human papillomavirus and cervica neoplasia[j]. cancer invest, 2002,20(7-8):1080-1085.
[3] kornegay jr,roger m, davies po, et al. international proficiency study of a consensus l1 pcr assay for the detection and typing of human papillomavirus dna: evaluation of accuracy and intralaboratory and interlaboratory agreement[j]. j clin microbiol, 2003, 41(3):1080-1086.
[4] clifford gm, rana rk, franceschi s, et al. human papillomavirus genotype distribution in low-grade cervical lesions: comparison by geographic region and with cervical cancer[j]. cancer epidemiol biomarkers prev, 2005,14(5):1157-1164.
